紅絲線藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

曹慶璽，鄧潔媚，姬生國(guó)，王 東（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

紅絲線藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

曹慶璽＊，鄧潔媚，姬生國(guó)，王 東#（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

目的：建立紅絲線藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為ODS-C18，流動(dòng)相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為20 μl。以2號(hào)色譜峰為參照峰，測(cè)定11批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：11批藥材樣品HPLC圖譜有10個(gè)共有峰，相似度均≥0.965。經(jīng)驗(yàn)證，11批樣品HPLC圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性。結(jié)論：該試驗(yàn)所建立的HPLC指紋圖譜專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定，可作為紅絲線藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要依據(jù)之一。

紅絲線；指紋圖譜；高效液相色譜法；質(zhì)量評(píng)價(jià)

紅絲線Lycianthes biflora，又名山藍(lán)、紅藍(lán)、觀音草，來(lái)源于爵床科紅絲線草屬植物紅絲線Peristrophe roxburghiana（Schult.）Brem.的全草，主產(chǎn)于云南、四川南部、廣西、廣東、江西、福建、臺(tái)灣等地。作為一種民間草藥，其常用于止咳祛痰和治咯血、跌打損傷等癥?！冻Ｓ弥胁菟幨謨?cè)》載：“淡涼，散瘀、止血，治跌打淤腫、急性扭挫傷、內(nèi)傷咳血”[1]?！度珖?guó)中草藥匯編》載：“甘、淡、涼。清肺止咳，散瘀止血。治肺結(jié)核咯血、肺炎、糖尿病、跌打損傷腫痛”[2]。研究表明，紅絲線含有可食用的、無(wú)毒的天然色素[3-4]，還具有多種活性成分[5]，如生物堿[6]、萜類(lèi)化合物[7]、有機(jī)酸[8]、黃酮類(lèi)化合物[9]、揮發(fā)油[10]、脂肪族化合物及微量元素等[11]；紅絲線提取物具有降壓[12]、保肝護(hù)肝[13]、鎮(zhèn)咳止咳[14]、抗氧化[15]等藥理作用。但目前市售紅絲線藥材質(zhì)量參差不齊，甚有摻假，嚴(yán)重影響了用藥的安全性和有效性。本課題組擬通過(guò)對(duì)紅絲線藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜進(jìn)行研究，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀（包括SPD-20A二極管陣列檢測(cè)器）、BP211B型電子天平（日本Shimadzu公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑

甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

11批樣品（見(jiàn)表1）經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院姬生國(guó)教授鑒定為真品。樣品經(jīng)低溫干燥后粉碎過(guò)60目篩，保存于密封袋內(nèi)，置于干燥器中，備用。

表1 紅絲線藥材來(lái)源Tab 1 Source of L.biflora

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～60 min，20%→90%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30Ⅱ；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品粉末1 g，置于錐形瓶中，加75%乙醇20 ml，超聲處理60 min，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，以5 ml 80%甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以2號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：120817J3 02）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以2號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：120817J302）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以2號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與對(duì)照?qǐng)D譜的生成

2.4.1 指紋圖譜的建立 取11批樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得特征指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1。

圖1 11批樣品高效液相色譜指紋圖譜Fig 1 HPLC chromatograms fingerprint of 11 batches of samples

2.4.2 對(duì)照?qǐng)D譜的生成 采用國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批樣品HPLC圖譜進(jìn)行圖譜擬合，生成對(duì)照?qǐng)D譜，詳見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，11批樣品HPLC圖譜共有特征峰10個(gè)，其中2號(hào)色譜峰的峰形好、分離度高、含量高，因此選擇作為參照峰。

圖2 11批樣品高效液相色譜對(duì)照?qǐng)D譜Fig 2 HPLC chromatograms control of 11 batches of samples

2.5 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批樣品HPLC圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2顯示，11批樣品HPLC圖譜雖然共有峰面積存在一定的差異，但整體特征相似，其相似度均≥0.965，說(shuō)明11批樣品HPLC圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性；不同批次藥材雖有差異但仍具有較好的相關(guān)性。

表2 11批樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation results of 11 batches of samples

2.6 變質(zhì)樣品的檢測(cè)

取樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜并與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行疊加對(duì)比，詳見(jiàn)圖3。圖3表明，兩者圖譜差異明顯，變質(zhì)的藥材樣品HPLC圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度僅為0.609，遠(yuǎn)小于規(guī)定的0.90。

圖3 變質(zhì)樣品與正品的高效液相色譜圖A.變質(zhì)樣品；B.變質(zhì)樣品與正品疊加圖譜Fig 3 HPLC chromatograms of degenerate sample and genuine sampleA.degenerate sample；B.superposed of degenerate sample and genuine sample

3 討論

試驗(yàn)初期，筆者以蒸餾水，60%、100%甲醇和30%、50%、70%、75%、95%乙醇這8種溶劑作為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，以75%乙醇作為提取溶劑，所得供試品溶液出峰數(shù)相對(duì)較多。故最終選取75%乙醇作為提取溶劑。

以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)洗脫的共有峰分離度不高，幾個(gè)共有峰融合為一個(gè)峰，故選用分離度相對(duì)較好的甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)；并選取了能使基線穩(wěn)定、各峰均能有所體現(xiàn)的370 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)所構(gòu)建的紅絲線藥材HPLC指紋圖譜有10個(gè)共有色譜峰，相似度均≥0.965，說(shuō)明該指紋圖譜可以代表紅絲線藥材的鑒別特征；通過(guò)與變質(zhì)樣品的HPLC圖譜比較，可以很直觀地看出變質(zhì)樣品的各色譜峰與對(duì)照?qǐng)D譜相似度差別很大，而這也可以作為變質(zhì)藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。綜上所述，本試驗(yàn)所建立的HPLC指紋圖譜專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定，可作為紅絲線藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要依據(jù)之一。

[1] 廣州部隊(duì)后勤衛(wèi)生部.常用中草藥手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1969：852-853.

[2] 謝宗萬(wàn).全國(guó)中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：266.

[3] 姚小青，劉曉明，楊朝竣，等.山藍(lán)中紅絲線素的分離純化研究與含量測(cè)定[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47（19）：1 535.

[4] 謝運(yùn)昌.紅絲線色素的提取和應(yīng)用研究[J].廣西輕工業(yè)，1993（3）：29.

[5] 劉同方，于華忠，劉建蘭，等.紅絲線化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（19）：116.

[6] 暴惠賓.紅絲線化學(xué)成分研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2009.

[7] 陳伯財(cái)，鐘銳，姬生國(guó).十萼茄的生藥學(xué)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（3）：259.

[8] 徐玉琳，張尚榮，張少歡，等.HPLC法測(cè)定紅絲線草中紅絲線素含量[J].中藥材，2008，31（8）：1 180.

[9] 蔣紅芝，陸春何.分光光度法測(cè)定紅藍(lán)草中總黃酮的含量[J].廣西輕工業(yè)，2009（9）：18.

[10] 郭夫江，李援朝.麻栗坡紅絲線中的酚類(lèi)和酰胺類(lèi)成分[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（18）：2 507.

[11] 謝運(yùn)昌，程菊英，蔣躍華，等.紅絲線色素中的微量元素[J].廣西輕工業(yè)，1994（3）：24.

[12] 徐玉琳，李英，林秋曉，等.紅絲線草醇提取物的降壓作用研究[J].今日藥學(xué)，2011，21（2）：77.

[13] 秦樹(shù)森，劉笑甫，張可鋒.紅絲線多糖對(duì)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（5）：559.

[14] 林志云，利紅宇.紅絲線的鎮(zhèn)咳祛痰和免疫藥效研究[J].廣東藥學(xué)，2004，14（1）：37.

[15] 楊朝竣，劉曉明，晉興華，等.山藍(lán)中的色素成分鑒定及體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（18）：156.

Study on HPLC Fingerprint of Lycianthes biflora

CAO Qingxi，DENG Jiemei，JI Shengguo，WANG Dong（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprints of Lycianthes biflora.METHODS：HPLC was performed on the column of Dima ODS-C18with mobile phase of methanol-water（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 370 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.Using chromatographic peak 2，the HPLC chromatograms of 11 batches were determined，and common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Fingerprint Similarity Evaluation System of Traditional Chinese Medicine（version A in 2004）.RESULTS：There were 10 common peaks in the HPLC chromatograms of 11 batches，the similarity was no lower than 0.965.According to the verification，the HPLC chromatograms of 11 batches and reference patterns had a good consistency.CONCLUSIONS：The established fingerprint is specific，stable，and can be used for one of the main basis of quality evaluation of L.biflora.

Lycianthes biflora；Fingerprint；HPLC；Quality evaluation

R284.1

A

1001-0408（2016）36-5130-03

2015-12-31

2016-02-28）

（編輯：張 靜）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009B030801044）

＊碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量控制。E-mail：caoqingxi_ 0223@163.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量分析。電話：020-39352181。E-mail：jsgwdxy@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.28