HPLC法測定萘普生固體脂質納米粒中主成分的含量Δ

付 佳，高賽男，周學剛，辛 萍，孫世芹（哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)藥學院，黑龍江大慶 163319）

HPLC法測定萘普生固體脂質納米粒中主成分的含量Δ

付 佳＊，高賽男，周學剛，辛 萍，孫世芹#（哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)藥學院，黑龍江大慶 163319）

目的：建立測定萘普生固體脂質納米粒中主成分含量的方法。方法：采用微乳法制備萘普生固體脂質納米粒，并采用高效液相色譜法測定含量。色譜柱為Elite C18，流動相A為甲醇、流動相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（磷酸調節(jié)pH至3.0）（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為240 nm，柱溫為25Ⅱ，進樣量為20μl。結果：萘普生檢測質量濃度線性范圍為0.2～180.0μg/ml（r＝0.999 7）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜1%；加樣回收率為98.97%～100.67%，RSD＝0.50%（n＝9）。結論：該方法簡便、精確，可排除萘普生固體脂質納米粒中輔料的干擾，適用于其中主成分的含量測定。

萘普生固體脂質納米粒；高效液相色譜法；含量測定

萘普生（Naproxen，Nap）又名甲氧異丙酸，化學名（+）-α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，是一種非甾體抗炎藥，具有明顯的抑制前列腺素合成的作用，可使前列腺素的釋放減少甚至停止，因而有較強的消炎、解熱和鎮(zhèn)痛作用，臨床主要用于治療風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎及強直性脊椎炎等[1]。Nap的常用劑型有片劑、膠囊、顆粒劑和注射劑等，而使用這些劑型可能出現不同程度的胃部不適、胃潰瘍及心血管系統不良反應[2]。固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一種新型的納米粒給藥系統，具有物理穩(wěn)定性高、可控制藥物釋放、可避免藥物降解或泄漏以及靶向性好、無毒等優(yōu)點[3-4]。筆者以硬脂酸為油相，大豆磷脂為表面活性劑，牛黃膽酸鈉為助表面活性劑[5]，利用微乳法[6]成功制備了Nap固體脂質納米粒（Nap-SLN），可避免使用Nap常規(guī)口服或注射劑型可能引發(fā)的不良反應，從而利于達到更好的治療效果。此前國內外已有采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色譜法（HPLC）測定Nap含量的文獻報道[7-8]。但是，由于Nap-SLN中輔料的存在，沿用藥典或文獻報道的方法測定其中主成分的含量可能會存在干擾。因此，本試驗在已有的國內外相關文獻報道基礎上探索了新的測定Nap-SLN中主成分含量的HPLC法，旨在為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，包括SIL-20A型自動進樣器、LC solution色譜工作站等（日本島津公司）；KH-500SPV型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；HH-1型數顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；JY92-11型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1650-W型

???????????????????????????????????????????????????????????????臺式微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅱ）型循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

Nap對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100198-201205，純度：99.6%）；Nap原料藥（西安昊軒生物科技有限公司，批號：10061212，純度：98%）；Nap-SLN（哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)藥學院自制，批號：20150801、20150802、20150803）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 Nap-SLN的制備

在查閱大量文獻的基礎上[9]，擬定SLN的處方為：硬脂酸199 mg、大豆磷脂108 mg、牛黃膽酸鈉355 mg。應用微乳法制備Nap-SLN，以納米粒的粒徑分布為考察指標分別對超聲分散功率、超聲分散時間、磁力攪拌溫度、磁力攪拌強度、磁力攪拌時間及稀釋倍數等因素進行單因素試驗，由此確定制備Nap-SLN的最佳工藝條件具體為：磁力攪拌溫度控制在70Ⅱ，將硬脂酸和Nap原料藥混合熔融作為油相，在600 r/min磁力攪拌速度下，將相同溫度的含有表面活性劑的水相大豆磷脂和牛黃膽酸鈉分別滴入油相中，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌20 min，形成初乳。將初乳加至1 ml的2～3Ⅱ冷水中，超聲（功率：200 W，頻率：25 kHz）分散3 min，得Nap-SLN分散液，冷凍干燥24 h，即得Nap-SLN凍干粉。

2.2 色譜條件

色譜柱：Elite C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為甲醇、流動相B為0.01mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（磷酸調節(jié)pH至3.0），梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 ml/min；進樣量：20μl；檢測波長：240 nm；柱溫：25Ⅱ。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取干燥至恒質量的Nap對照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為1 000μg/ml的Nap對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取干燥至恒質量的Nap-SLN 10.0 mg（以Nap計），置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，濾過，準確量取續(xù)濾液1.2 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為120μg/ml的Nap供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液 取處方量的硬脂酸、大豆磷脂、牛黃膽酸鈉，按“2.3.2”項下方法操作制成陰性對照溶液。

2.4 陰性干擾試驗

分別量取“2.3”項下的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，對照品和供試品均在10.210 min處出現吸收峰，而陰性對照在此處無吸收峰出現，表明陰性對照對主成分Nap的含量測定無干擾。

2.5 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.NapFig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance solution；B.test sample solution；C.negative con trol solution；1.naproxen

將“2.3.1”項下的對照品溶液分別用甲醇稀釋制成質量濃度為0.2、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0和180.0μg/ml的系列對照品溶液，分別按“2.2”項下色譜條件注入HPLC儀，進樣測定，記錄峰面積。以Nap的峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝39 213x+ 42 880（r＝0.999 7）。結果表明，Nap檢測質量濃度線性范圍為0.2～180.0μg/ml。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.5”項下質量濃度為160μg/ml的對照品溶液20μl，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，Nap峰面積的RSD＝0.65%（n＝6），說明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取按“2.3.2”項下方法制備的供試品溶液（批號：20150801）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時取20 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，Nap峰面積的RSD＝0.28%（n＝6），說明供試品溶液在室溫放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批（批號：20150801）樣品適量，共6份，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，Nap峰面積的RSD＝0.84%（n＝6），說明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20150801）7.5 mg，共9份，分別置于量瓶中，對照品按80%、100%、120%的量各加3份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算主成分的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

參考2015年版《中國藥典》（二部）“萘普生”[10]項下的色譜條件，選擇流動相A為甲醇、流動相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（磷酸調節(jié)pH至3.0）（75∶25，V/V），分別采用藥典中的Nap紫外吸收波長262、272、317和331 nm用于測定Nap-SLN時，可能由于輔料的干擾使Nap的峰形、保留時間均不理想。而Haque T等[11]曾報道了在240 nm波長下對Nap和鹽酸雷尼替丁混合制劑進行分析，故本試驗嘗試采用該波長測定Nap-SLN中主成分Nap的含量。結果表明，在該波長下Nap-SLN中的輔料不干擾主成分的測定，峰形、保留時間均較理想。

3.2 流動相梯度洗脫程序的確定

有機相在整個流動相中所占比例對靈敏度、分離度以及分離時間均有明顯的影響。為了使Nap-SLN中主成分Nap與輔料有效分離，本試驗對梯度洗脫程序進行了考察。結果，確定了最佳梯度洗脫程序：甲醇初始體積為50%，恒定1 min，在1～2 min時由50%增加至65%，在2～5 min時由65%增加至70%，在5～7 min時由70%增加至90%，在7～10 min時由90%減少至50%，再恒定5 min。通過此梯度洗脫程序可使Nap保留時間適中，峰形較好，分離度符合要求。

3.3 樣品含量測定結果分析

本試驗建立了新的測定Nap-SLN中主成分含量的HPLC法，從含量測定結果可知，各批次的Nap-SLN中Nap含量無明顯差異。試驗結果表明，本方法簡便、精確，可排除Nap-SLN中輔料的干擾，適用于其中主成分的含量測定。為該制劑包封率檢測等理化性質評價及活性測定等相關后續(xù)研究奠定了方法學基礎。

[1] 張倫.萘普生市場透析[J].中國藥房，2003，14（6）：326.

[2] 李鵬，田青平，李菁.萘普生微乳經皮給藥系統的處方前研究[J].中國新藥雜志，2008，17（22）：1 948.

[3] Harde H，Das M，Jain S.Solid lipid nanoparticles：an oral bioavailability enhancer vehicle[J].Expert Opin Drug Deliv，2011，8（11）：1 407.

[4] 夏愛曉，宋倩倩，孫淵.固體脂質納米粒制備及應用研究進展[J].藥學實踐雜志，2012，30（5）：331.

[5] Madan J，Pandey RS，Jain V，et al.Poly（ethylene）-glycol conjugated solid lipid nanoparticles of noscapine improve biological half-life，brain delivery and efficacy in glioblastoma cells[J].Nanomedicine，2013，9（4）：492.

[6] 毛世瑞，王燕芝，紀宏宇，等.微乳化技術制備固體脂質納米粒[J].藥學學報，2003，38（8）：624.

[7] 詹國平，潘道麗.紫外分光光度法測定萘普生-β-環(huán)糊精包合物中萘普生的含量[J].中國藥房，2006，17（15）：1 175.

[8] Zakeri-Milani P，Barzegar-Jalali M，Tajerzadeh H，et al. Simultaneous determination of naproxen，ketoprofen and phenol red in samples from rat intestinal permeability studies：HPLC method development and validation[J].J Pharm Biomed Anal，2005，39（3/4）：624.

[9] Marengo E，Cavalli R，Caputo O，et al.Scale-up of the preparation process of solid lipid nanospheres.part I[J].Int J Pharm，2000，205（1/2）：3.

[10] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1 208-1 209.

[11] Haque T，Talukder MM，Laila S，et al.Development and validation of a RP-HPLC method for simultaneous estimation of naproxen and ranitidinehydrochloride[J].Pak J Pharm Sci，2010，23（4）：379.

Content Determination of Main Ingredient in Naproxen Solid Lipid Nanoparticles by HPLC

FU Jia，GAO Sainan，ZHOU Xuegang，XIN Ping，SUN Shiqin[College of Pharmacy，Harbin Medical University（Daqing Area），Heilongjiang Daqing 163319，China]

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of main ingredient in naproxen solid lipid nanoparticles.METHODS：Microemulsion method was used to prepare naproxen solid lipid nanoparticles，and HPLC was used for the content determination.The column was Elite C18with mobile phase A of methanol and B of 0.01mol/L KH2PO4buffer solution（adjust pH to 3.0 by phosphoric acid）（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 240 nm，column temperature was 25Ⅱ，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range of naproxen was 0.2-180.0μg/ml（r＝0.999 7）；RSDs of precision，stability and reproducibility were lower than 1.00%；recovery was 99.73%-100.29%（RSD＝0.20%，n＝9）. CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，and can exclude the accessories’interference in naproxen solid lipid nanoparticles，which is suitable for the content determination of main ingredient.

Naproxen solid lipid nanoparticles；HPLC；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2016）36-5127-03

2015-12-30

2016-11-09）

（編輯：周 箐）

黑龍江省自然科學基金資助項目（No.C2007-01）；大慶市指導性科技計劃項目（No.szd-2015-12）

＊碩士。研究方向：類風濕性關節(jié)炎。E-mail：13159826215@ 163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：類風濕性關節(jié)炎。電話：0459-8153631。E-mail：ssq7610@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.27