2015年版《中國(guó)藥典》環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的驗(yàn)證與改進(jìn)Δ

雷成康，郭 玲（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

·藥物分析與檢定·

2015年版《中國(guó)藥典》環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的驗(yàn)證與改進(jìn)Δ

雷成康1＊，郭 玲2#（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

目的：改進(jìn)環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。方法：對(duì)2015年版《中國(guó)藥典》收載的環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的薄層色譜法（TLC）進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，以環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對(duì)照品為對(duì)照，以二氯甲烷-冰乙酸-甲醇-水（50∶25∶15∶12 V/V/V/V）為展開(kāi)劑，以茚三酮試液為顯色劑，進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)及方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：原TLC法不僅無(wú)法檢測(cè)到環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)B、C、D，且操作過(guò)程煩瑣，不夠環(huán)保。改進(jìn)后的TLC法對(duì)環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A的檢測(cè)限約為0.05 μg，對(duì)有關(guān)物質(zhì)B、C、D的檢測(cè)限約為0.1 μg；方法專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺與各有關(guān)物質(zhì)之間互不干擾，分離度良好。結(jié)論：改進(jìn)的TLC法具有簡(jiǎn)便、環(huán)保、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于環(huán)磷酰胺及其制劑的質(zhì)量控制。

環(huán)磷酰胺；有關(guān)物質(zhì)；薄層色譜法；改進(jìn)

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide），分子式C7H15C12N2O2P· H2O，化學(xué)名為P-[N，N-雙（β-氯乙基）]-1-氧-3-氮-2-磷雜環(huán)己烷-P-氧化物一水合物，是目前臨床應(yīng)用非常廣泛的抗腫瘤藥。環(huán)磷酰胺主要以二乙醇胺為起始原料，與氯化亞砜、三氯氧磷及氨基丙醇等經(jīng)氯化、縮合、環(huán)合而成，其生產(chǎn)工藝對(duì)溫度及反應(yīng)時(shí)間有嚴(yán)格要求。若其生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵因素控制不當(dāng)會(huì)引起有關(guān)物質(zhì)含量顯著增加；另外，若其長(zhǎng)期貯藏于30Ⅲ以上的環(huán)境中，則易失去結(jié)晶水，引起脫氯而呈黏稠狀[1]。

2015年版《中國(guó)藥典》（二部）收載的檢測(cè)環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)的方法為自身稀釋對(duì)照的薄層色譜法（TLC）[2]，該方法不針對(duì)任何特定物質(zhì)。而已知的環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)有4種，分別為有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D，其中有關(guān)物質(zhì)A、B既是工藝雜質(zhì)也是降解雜質(zhì)；而有關(guān)物質(zhì)C、D一般在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A為二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽，具高毒性，大鼠腹腔半數(shù)致死量（LD50）為100 mg/kg，小鼠皮下LD50為20 mg/kg，對(duì)人亦有致突變作用[3]。其他3種環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)毒理學(xué)資料暫缺，但就藥品質(zhì)量控制而言，仍有必要對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)。

經(jīng)檢索有關(guān)環(huán)磷酰胺質(zhì)量研究文獻(xiàn)[3-9]，僅袁紅露[3]對(duì)環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)進(jìn)行了研究，但其方法為離子色譜法（IC）與高效液相色譜法（HPLC）兩種方法的結(jié)合，雖能較精確地定量，但操作方法復(fù)雜，檢測(cè)成本較高，實(shí)用意義稍低。筆者在承擔(dān)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品抽驗(yàn)科研項(xiàng)目（環(huán)磷酰胺）期間，對(duì)原有的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的TLC法進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)將相關(guān)情況報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

預(yù)制硅膠G薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號(hào)：20140326，規(guī)格：100 mm×200 mm，厚度：0.2～0.25 mm）；BT25S型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用環(huán)磷酰胺樣品（共47批，江蘇某制藥公司22批，山西某制藥公司20批，吉林某制藥公司5批，規(guī)格均為0.2 g）；環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)：170475）、有關(guān)物質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)：171256）、有關(guān)物質(zhì)C對(duì)照品（批號(hào)：170476）均購(gòu)自加拿大TRC公司，有關(guān)物質(zhì)D對(duì)照品（批號(hào)：F01375）購(gòu)自美國(guó)藥典委員會(huì)，標(biāo)示純度均≥98.0%；茚三酮、無(wú)水甲酸、丙酮、丁酮、冰乙酸、甲醇、二氯甲烷、乙醇、鹽酸、高錳酸鉀、碘化鉀、淀粉等均為分析純，水為自制實(shí)驗(yàn)用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原TLC法與方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 原TLC法 取適量的注射用環(huán)磷酰胺樣品，用乙醇配制成一定質(zhì)量濃度的溶液作為供試品溶液，再將此溶液稀釋100倍作為對(duì)照溶液。分別取以上兩種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用丁酮-水-丙酮-無(wú)水甲酸（80∶12∶4∶2，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，在暖氣流下晾干后，于110Ⅲ加熱10 min。在另一展開(kāi)缸底放置一適宜容器，加入適量高錳酸鉀溶液和鹽酸以產(chǎn)生氯氣，將展開(kāi)后的薄層板趁熱放入此展開(kāi)缸中，蓋上蓋子。使薄層板與氯氣接觸2 min，取出薄層板，將其置于冷氣流中，去除多余的氯氣，直至在點(diǎn)樣處的下方滴1滴碘化鉀淀粉溶液后，薄層板僅顯極淺的藍(lán)色（避免薄層板過(guò)長(zhǎng)時(shí)間暴露于冷氣流中）。噴以碘化鉀淀粉溶液，放置5 min后立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)（除原點(diǎn)外），其顏色不得深于對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)（1.0%）。

2.1.2 原TLC法的專屬性驗(yàn)證 取注射用環(huán)磷酰胺樣品及各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品適量，以乙醇配制環(huán)磷酰胺質(zhì)量濃度為20 mg/ml及有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D質(zhì)量濃度為20 μg/ml的混合溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，吸取上述混合溶液各點(diǎn)樣1、2、3、4、5 μl，依法展開(kāi)并顯色，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 原方法的專屬性驗(yàn)證薄層色譜圖1.1 μl；2.2 μl；3.3 μl；4.4 μl；5.5 μlFig 1 TLC chromatograms of specificity verification by the original method1.1 μl；2.2 μl；3.3 μl；4.4 μl；5.5 μl

結(jié)果顯示，原TLC法僅能檢出環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A，而有關(guān)物質(zhì)B、C、D均未能檢出。而未能檢出環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)B、C、D的原因是，展開(kāi)劑丁酮-水-丙酮-無(wú)水甲酸（80∶12∶4∶2，V/V/V/V）僅能展開(kāi)有關(guān)物質(zhì)A，有關(guān)物質(zhì)B、C、D基本停留在原點(diǎn)未展開(kāi)，呈現(xiàn)為一混合斑點(diǎn)，其Rf值均為0。

2.1.3 原TLC法存在的問(wèn)題 原TLC法不僅無(wú)法檢測(cè)到已知的環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)B、C、D，且操作過(guò)程異常煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其過(guò)程中還使用了國(guó)家管制試劑（高錳酸鉀、鹽酸、丙酮、丁酮均為易制毒試劑）并生成有毒有害物質(zhì)（氯氣）。

2.2 改進(jìn)后的TLC法與方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 改進(jìn)后的TLC法 取注射用環(huán)磷酰胺樣品適量，以50%甲醇制成環(huán)磷酰胺質(zhì)量濃度為20 mg/ml的供試品溶液；取供試品溶液1 ml，置于200 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。另取各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品適量，以50%甲醇分別配制有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D質(zhì)量濃度為20 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。取上述3種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-冰乙酸-甲醇-水（50∶25∶15∶12，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)約10 cm，取出，晾干，噴以茚三酮試液，于105Ⅲ加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，立即檢視。供試品溶液色譜中如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，其顏色不得深于相應(yīng)的對(duì)照品溶液斑點(diǎn)（0.1%），其他斑點(diǎn)顏色不得深于對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)（0.5%）。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 改進(jìn)后方法的薄層色譜圖A.有關(guān)物質(zhì)A對(duì)照品溶液；B.有關(guān)物質(zhì)B對(duì)照品溶液；C.有關(guān)物質(zhì)C對(duì)照品溶液；D.有關(guān)物質(zhì)D對(duì)照品溶液；E.對(duì)照溶液；F.供試品溶液Fig 2 TLC chromatograms of improved methodsA.reference substance solution of related substance A；B.reference substance solution of related substance B；C.reference substance solution of related substance C；D.reference substance solution of related substance D；E.reference solution；F.test sample solution

2.2.2 檢測(cè)限考察 精密稱取環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對(duì)照品各適量，以50%甲醇分別溶解并制成1 ml約各含1 μg的溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，吸取上述溶液各點(diǎn)樣1、2、3、4、5 μl，依法展開(kāi)并顯色，以目視能檢出清晰斑點(diǎn)的最低量為檢測(cè)限。結(jié)果，該方法對(duì)環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A的檢測(cè)限約為0.05 μg，對(duì)有關(guān)物質(zhì)B、C、D的檢測(cè)限約為0.1 μg。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取注射用環(huán)磷酰胺樣品及各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品適量，以50%甲醇配制環(huán)磷酰胺質(zhì)量濃度為20 mg/ml及有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D質(zhì)量濃度為20 μg/ml的混合溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，吸取上述混合溶液各點(diǎn)樣1、2、3、4、5 μl，依法展開(kāi)并顯色。結(jié)果，采用改進(jìn)后的TLC法，環(huán)磷酰胺的Rf值約為0.97，有關(guān)物質(zhì)A的Rf值約為0.75，有關(guān)物質(zhì)B的Rf值約為0.54，有關(guān)物質(zhì)C的Rf值約為0.45，有關(guān)物質(zhì)D的Rf值約為0.35。環(huán)磷酰胺與各有關(guān)物質(zhì)之間分離良好。

2.2.4 空白試驗(yàn) 以50%甲醇溶液為空白溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件點(diǎn)樣5 μl，依法展開(kāi)并顯色。結(jié)果，空白溶液未出現(xiàn)與各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液主斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，也未出現(xiàn)其他斑點(diǎn)，表明空白溶液不會(huì)對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

2.2.5 樣品驗(yàn)證 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件和方法對(duì)收集到的47批注射用環(huán)磷酰胺樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。結(jié)果，僅部分樣品檢出了有關(guān)物質(zhì)A，但均符合“2.2.1”項(xiàng)下的相關(guān)限度規(guī)定；同時(shí)均未檢出有關(guān)物質(zhì)B、C、D及其他有關(guān)物質(zhì)。

3 討論

環(huán)磷酰胺及其各種有關(guān)物質(zhì)均為含氮有機(jī)物，分子中具胺的結(jié)構(gòu)，根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，采用茚三酮試液來(lái)顯色，具有靈敏度高、直觀、反應(yīng)迅速的特點(diǎn)，且與原方法所用顯色劑氯氣相比，具有過(guò)程簡(jiǎn)便、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。本方法中，環(huán)磷酰胺有關(guān)物質(zhì)A顯色后呈橘黃色斑點(diǎn)，有關(guān)物質(zhì)B、C、D顯色后均呈紫紅色斑點(diǎn)。

總結(jié)預(yù)試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn)研究結(jié)果，本方法的操作關(guān)鍵點(diǎn)為：（1）薄層板臨用前須經(jīng)105Ⅲ活化0.5 h；（2）展開(kāi)劑及顯色劑茚三酮試液均需臨用新配；（3）展距以不超過(guò)10 cm為佳；（4）展開(kāi)后取出薄層板，以微熱風(fēng)（40～50Ⅲ）迅速干燥，并及時(shí)噴以顯色劑；（5）加熱顯色時(shí)間以5～8 min為宜，應(yīng)隨時(shí)觀察，顯色清晰后即可取出。

綜上所述，本方法具有簡(jiǎn)便、環(huán)保、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)47批環(huán)磷酰胺制劑驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看方法可行性較好，可用于環(huán)磷酰胺及其制劑的質(zhì)量控制，并可供相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂和提高時(shí)參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部藥典注釋[S].1990：310.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：586.

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[5] 梁云愛(ài)，李見(jiàn)春，門(mén)孝英.環(huán)磷酰胺及其制劑的二階導(dǎo)數(shù)差示脈沖極譜法定量研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36（9）：620.

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Validation and Improvement of the Detection Method for Cyclophosphamide Related Substances in Chinese Pharmacopoeia（2015 Edition）

LEI Chengkang1，GUO Ling2（1.Xi’an Institute for Food and Drug Control，Xi’an 710054，China；2.College of Life Sciences；Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China）

OBJECTIVE：To improve the detection method for the related substances of cyclophosphamide.METHODS：The TLC for the detection method of the cyclophosphamide related substances in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）was verified；the TLC was improved with references of compound A，B，C，D，the expanding agent of dichloromethane-acetic acid-methanol-water（50∶25∶15∶12，V/V/V/V）and the chromogenic agent of ninhydrin solution，and the detection test and methodology validation were conducted for the related substances.RESULTS：The original TLC can not detect the cyclophosphamide related compound B，C，D and the operation process was cumbersome and not environmental protection.The detection limit of improved TLC for cyclophosphamide related compound A was 0.05 μg，and 0.1 μg for related compound B，C，D；specificity method test results showed that cyclophosphamide and the related compounds did not interfere with each other with a good separation.CONCLUSIONS：Improved TLC has the advantages of simplicity，environmental protection and high sensitivity，which can be used for the quality control of cyclophosphamide and its preparations.

Cyclophosphamide；Related compound；TLC；Improvement

R927

A

1001-0408（2016）36-5122-03

2015-12-31

2016-10-30）

（編輯：周 箐）

2014年國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)項(xiàng)目（No.111）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：藥品檢驗(yàn)及新藥研發(fā)。電話：029-85535543。E-mail：cklei168@163.com

#通信作者：實(shí)驗(yàn)師，博士研究生。研究方向：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及藥物分析。E-mail：glalguo@snnu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.25