骨保護素基因多態(tài)性與椎間盤退變的相關性研究

薛靜波，王文軍，晏怡果，王 程，詹新立

基礎研究

骨保護素基因多態(tài)性與椎間盤退變的相關性研究

薛靜波，王文軍，晏怡果，王 程，詹新立

目的探討骨保護素基因3種常見位點多態(tài)性950T/C（rs2073617）、1181G/C（rs2073618）和163A/G（rs3102735）及骨保護素蛋白表達水平與椎間盤退變的相關性。方法選擇2013年1月至2014年5月于南華大學附屬第一醫(yī)院就診的200例椎間盤退變患者作為病例組，同期體檢的200例健康志愿者作為對照組。采用PCR-RFLP法檢測研究對象骨保護素基因rs2073617、rs2073618和rs3102735位點基因型和單倍型頻率分布情況，運用ELISA法檢測血清骨保護素水平。采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果病例組和對照組骨保護素基因rs2073617多態(tài)性的等位基因和基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），攜帶C等位基因可能會增加椎間盤退變風險[OR=1.79（1.33～2.41），P＜0.001]，但兩組rs2073618和rs3102735多態(tài)性等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。攜帶骨保護素基因rs2073617多態(tài)性3種不同基因型（TT、TC和CC）椎間盤退變患者的血清骨保護素水平均明顯高于健康對照組（均P＜0.05）；而攜帶rs3102735和rs2073618多態(tài)性不同基因型患者的血清骨保護素水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。單倍型分析結(jié)果顯示，骨保護素基因T-G-A單倍型可能是椎間盤退變的保護性因素（OR=0.62，95%CI=0.41～0.94，P=0.020），而C-G-G單倍型可能為椎間盤退變的危險因素（OR=2.24，95%CI=1.09～4.60，P=0.020）。Logistic回歸分析結(jié)果表明，低血清骨保護素水平與椎間盤退變發(fā)生風險呈正相關，而T-C-A、T-G-A和T-G-G單倍型與椎間盤退變發(fā)生風險呈負相關（均P＜0.05）。結(jié)論骨保護素基因rs2073617多態(tài)性可能與椎間盤退變有關，但rs2073618和rs3102735多態(tài)性可能不是增加椎間盤退變易感性的主要危險因素；骨保護素基因T-C-A、T-G-A和T-G-G單倍型可能是椎間盤退變的保護性因素，低血清骨保護素水平則可能是椎間盤退變的危險因素。

椎間盤退變；骨保護素；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；等位基因；基因型；基因頻率；疾病遺傳易感性；危險因素

椎間盤退變可表現(xiàn)為下腰痛、椎間盤突出及腰椎管狹窄，從而對患者的生活質(zhì)量造成一定影響[1]。其確切的病理機制尚不十分清楚，但已知基因和環(huán)境因素扮演了重要角色[2]。作為腫瘤壞死因子超受體家族中的一員，骨保護素（osteoprotegerin，OPG）水平發(fā)生變化被認為可能是椎間盤退變的病因之一[3]。有研究證實，基因變異可導致OPG血清水平的改變，包括950T/C（rs2073617）、1181G/C（rs2073618）和 163A/G（rs3102735）基因多態(tài)性的變化；此外，研究還發(fā)現(xiàn)OPG基因多態(tài)性與骨密度之間有一定的相關關系[4-5]。但目前OPG基因多態(tài)性與椎間盤退變之間的聯(lián)系并不明確。本研究探討OPG基因3種常見位點多態(tài)性950T/C（rs2073617）、1181G/C（rs2073618）、163A/G（rs3102735）及OPG蛋白表達水平與椎間盤退變的相關關系，旨在為進一步探明椎間盤退變的遺傳學發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2013年1月至2014年5月于南華大學附屬第一醫(yī)院被診斷為椎間盤退變的200例患者作為病例組，男100例，女100例，年齡40～62歲，平均年齡（53±7）歲。納入標準：有典型臨床癥狀、體征及相應MRI表現(xiàn)，術后病理證實為椎間盤組織明顯退變。排除標準：合并有腰椎管狹窄者。對照組為同期體檢的200例健康成年志愿者，男100例，女100例，年齡42～62歲，平均年齡（52±5）歲，腰椎MRI正常。本研究經(jīng)南華大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批同意，所有受試者均簽署知情同意書。病例組和對照組在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、是否吸煙等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要實驗試劑及設備

主要實驗試劑：全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；rs2073617引物、rs2073618引物、rs3102735引物（上海生工生物工程公司）；特異性限制性內(nèi)切酶（大連寶生物工程有限公司）；TaqDNA聚合酶（北京天根生化科技有限公司）。主要設備：PCR板、PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程公司）；ELISA試劑盒（上海麗臣生物科技有限公司）；9700 PCR儀、基因分析儀（ABI公司，美國）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；分光光度計（Beckman公司，美國）。

1.3 標本采集

所有受試者空腹10～12 h，晨起抽取肘靜脈血10 mL，取3 mL加乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；其余血樣不添加抗凝劑，靜置1 h后常溫下以3 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，提取血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單核苷酸多態(tài)性檢測

采用PCR-RFLP法鑒定基因多態(tài)性，PCR引物用Primer Premier 5.0軟件設計，引物由上海生物工程公司合成。PCR反應體系25 μL，包括基因組DNA 100 ng，上下游引物各125 ng，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。使用特異性限制性內(nèi)切酶HincII、XspI和AseI識別PCR產(chǎn)物特異性位點，然后通過凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用ABI370型DNA測序儀進行測序鑒定，以判斷相應位點的基因型。引物序列及長度見表1。

1.5 蛋白檢測

采用ELISA法測定血清OPG水平，嚴格按試劑盒說明書操作。450 nm波長依序測量各孔的吸光度（optical density，OD值），用標準品的濃度和OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，以及對應的樣品濃度。所有的標本測定2次，取其平均值，檢測符合實驗室質(zhì)控標準。

1.6 單倍型構建

基于rs2073617和rs3102735兩個多態(tài)位點均位于OPG基因啟動子上，而rs2073618位于第一外顯子，且相互毗鄰，故運用以貝葉斯算法（Bayesian algorithm）為基礎的PHASE 2.1軟件，對3個多態(tài)性位點的基因型進行單倍體構建[6]。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對照組基因型及等位基因頻率采用Hardy-Weinberg平衡分析確定研究樣本的總體代表性。計量資料以（）表示，組間計量資料的比較采用方差分析或t檢驗，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)秩和檢驗。兩組之間基因型、等位基因和單倍型頻率分布采用χ2檢驗。通過Logistic回歸分析來確定椎間盤退變的風險因素，各因素與椎間盤退變患病風險之間的相關性用比值比（odds ratios，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）表示。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P＜

表1 PCR引物設計

0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分型

OPG rs2073617T/C基因多態(tài)性檢測結(jié)果：855 bp處出現(xiàn)單個條帶為野生TT純合子，雜合子TC產(chǎn)生855 bp、460 bp和395 bp三條帶；突變純合子CC產(chǎn)生395 bp、460 bp兩條帶。rs2073618G/C基因多態(tài)性檢測結(jié)果：野生型GG純合子基因不被酶切，仍為570 bp處一條帶，雜合子GC產(chǎn)生570 bp、522 bp和48 bp三條帶，突變純合子CC產(chǎn)生522 bp和48 bp兩條帶。rs3102735G/A野生型純合子A/A為161bp和139 bp兩條帶，雜合子G/A為300 bp、161 bp和139 bp三條帶，突變型純合子G/G 300 bp一條帶。DNA測序鑒定的結(jié)果亦證實上述rs2073617T/C、rs2073618G/C和rs3102735A/G位點3種基因型的存在（圖1）。

2.2 等位基因和基因型分布

OPG基因rs2073617、rs2073618和rs3102735位點的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡法則，表明各基因頻率已達遺傳平衡，所選擇的樣本具有群體代表性（均P＞0.05）。病例組和對照組OPG基因rs2073617多態(tài)性等位基因和基因型頻率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），攜帶C等位基因可能會增加椎間盤退變風險[OR=1.79（1.33～2.41），P＜0.001]，但兩組rs2073618和rs3102735多態(tài)性等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，表2）。

2.3 骨保護素表達

攜帶OPG基因rs2073617多態(tài)性3種不同基因型（TT、TC和CC）椎間盤退變患者的血清OPG水平均明顯低于健康對照組（均P＜0.05），且病例組中攜帶TC和CC基因型患者的OPG水平也明顯低于TT基因型攜帶者（均P＜0.05）。攜帶rs2073618和rs3102735多態(tài)性不同基因型患者的血清OPG水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖2。

2.4 單倍型頻率統(tǒng)計分析

圖1 骨保護素基因型測序圖

表2 病例組和對照組血清骨保護素基因3種不同位點基因型和等位基因頻率比較

圖2 病例組和對照組不同基因型血清骨保護素水平比較 注：與對照組比較，*P＜0.05；病例組內(nèi)比較#P＜0.05

采用PHASE 2.1軟件進行單倍體構建，共產(chǎn)生8種單倍體組合：T-C-A、T-C-G、C-C-A、C-C-G、T-G-A、T-G-G、C-G-A、C-G-G。單倍型分析結(jié)果顯示，OPG基因T-G-A單倍型可能是椎間盤退變的保護性因素（OR=0.62，95%CI=0.41～0.94，P=0.020），而C-G-G單倍型可能為椎間盤退變的危險因素（OR=2.24，95%CI=1.09～4.60，P=0.020）。

2.5 Logistic回歸分析

以椎間盤退變?yōu)橐蜃兞浚琌PG基因rs2073617、rs2073618和rs3102735 3個位點基因型及單倍型、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、OPG水平、年齡、性別作自變量，進行Logistic多元逐步回歸，并得出校正的比值比Exp（B）。分析結(jié)果表明：低血清OPG水平與椎間盤退變發(fā)生風險呈正相關，而T-C-A、T-G-A和T-G-G單倍型與椎間盤退變發(fā)生風險呈負相關（均P＜0.05，表3）。

3 討論

OPG是腫瘤壞死因子超受體家族的一種糖蛋白，同時也是一種破骨細胞形成抑制因子。研究證實其具有極為重要的調(diào)節(jié)骨質(zhì)代謝的功能，能夠抑制破骨細胞分化及骨吸收，促進骨形成，進而起到增加骨密度、防止骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用[6]。針對絕經(jīng)后婦女的研究結(jié)果表明，血清OPG水平與骨密度值呈正相關關系，提示OPG/RANKL/ RANK系統(tǒng)參與了絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程[7]。

此外，OPG與類風濕關節(jié)炎、骨性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展也有密切的相關性。有研究證實OPG/ RANKL/RANK系統(tǒng)參與了類風濕關節(jié)炎中骨侵蝕的發(fā)生，而對OPG/RANKL/RANK通路進行有效干預后，RANKL/OPG比值降低，能夠抑制破骨細胞的分化，從而阻斷骨質(zhì)破壞，減輕炎癥反應[8-9]。亦有不同學者對大鼠骨關節(jié)炎模型進行研究，結(jié)果表明，OPG能夠顯著對抗軟骨細胞凋亡，降低軟骨蛋白聚糖酶表達水平，減輕軟骨蛋白聚糖的降解作用，阻止軟骨蛋白聚糖的丟失，從而減緩骨關節(jié)炎的病變過程[10-11]。

大多數(shù)學者認為椎間盤的退變可能是由于軟骨終板增厚、鈣化，導致椎間盤營養(yǎng)減少、髓核變性，最后發(fā)展到退變、鈣化[12]；而OPG能夠阻止軟骨終板中破骨細胞介導的骨吸收，從而保持軟骨終板的完整性，減緩椎間盤退變的發(fā)生與進展[13]。人們在對人退變椎板的研究中發(fā)現(xiàn)血清OPG水平與椎間盤退變程度有顯著相關性，也有力證實了OPG在椎間盤退變中所發(fā)揮的作用[14]。但目前OPG與椎間盤退變之間的關系還不十分明確，因此，本研究探討OPG基因多態(tài)性與椎間盤退變的關系，試圖從遺傳基因?qū)W水平闡明椎間盤退變的發(fā)生機制。

我們發(fā)現(xiàn)OPG基因rs2073617多態(tài)性可能與椎間盤退變有關，但rs2073618和rs3102735多態(tài)性可能不是增加椎間盤退變易感性的主要危險因素；同時，我們還發(fā)現(xiàn)OPG 950T/C（rs2073617）多態(tài)性的C等位基因攜帶者較之T等位基因攜帶者罹患椎間盤退變的風險要高。如前所述，OPG基因在OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)中的主要作用在于擾亂破骨細胞分化和刺激成骨細胞活動，這意味著血清OPG水平具有調(diào)節(jié)骨形成與吸收的作用[15]；而破壞RANKL和OPG之間的平衡將使椎間盤在機械負荷的影響下出現(xiàn)軟骨退化，這可能是椎間盤退變或骨關節(jié)炎進展的重要機制[10-11]。

表3 椎間盤退變風險因素的回歸分析

單倍型分析結(jié)果顯示，OPG基因T-C-A、T-G-A和T-G-G單倍型可能是椎間盤退變的保護性因素，而C-G-G單倍型可能為椎間盤退變的危險因素。另外，研究中發(fā)現(xiàn)攜帶OPG基因rs2073617多態(tài)性3種不同基因型（TT、TC和CC）椎間盤退變患者的血清OPG水平均明顯低于健康對照組，提示這3種不同的基因型可能是椎間盤退變進展的危險因素。軟骨終板是椎間盤重要的生物力學結(jié)構之一，椎間盤的新陳代謝取決于軟骨終板與椎間盤之間的營養(yǎng)交換。推測OPG基因多態(tài)性可能通過影響血清OPG水平的方式在軟骨終板及椎間盤的退變中發(fā)揮作用。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測，與OPG基因rs2073617多態(tài)性相關的血清OPG水平降低可能作用于骨代謝及軟骨終板退變過程，最終導致椎間盤退變。

本研究亦有不足之處，病例組與對照組研究樣本量較少，未開展相關動物實驗，這也是我們下一步的研究計劃和方向。

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Associations between osteoprotegerin gene polymorphisms and intervertebral disc degeneration

XUE Jingbo*,WANG Wenjun,YAN Yiguo,WANG Cheng,ZHAN Xinli.*Department of Spine Surgery,the First Affiliated Hospital of Nanhua University,Hengyang,Hunan 421001,China

WANG Wenjun,E-mail:wwj1202@hotmail.com

Intervertebral disc degeneration;Osteoprotegerin;Polymorphisms,genetic;Alleles;Genotype; Gene frequency;Genetic predisposition to disease;Risk factors

R681.533，R394.3

A

1674-666X(2016)06-352-07

2016-10-20；

2016-11-22）

（本文編輯：白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2016.06.006

421001湖南衡陽，南華大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科（薛靜波，王文軍，晏怡果，王程）；530000廣西南寧，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨病科（詹新立）

王文軍，E-mail：wwj1202@hotmail.com

【Abstract】Objective To investigate the correlations of osteoprotegerin(OPG)-950T/C(rs2073617),-1181G/ C(rs2073618),-163A/G(rs3102735)polymorphisms,serum OPG levels,and intervertebral disc degeneration (IDD).Methods A total of 200 IDD patients treated in the First Affiliated Hospital of Nanhua University from January 2013 to May 2014 were recruited as the case group,and 200 healthy volunteers were selected as the control group simultaneously.Genotype and haplotype frequency distributions of OPG polymorphisms were analyzed by PCR-RFLP assay,serum OPG levels were measured by ELISA.SPSS 22.0 software was used to analyze.Results Genotype and allele frequencies of OPG rs2073617 polymorphism were significantly higher in case group compared to those in control group(P＜0.05).The C allele carriers showed a higher risk of IDD than T allele carriers[OR=1.79(1.33-2.41),P＜0.001].The genotype and allele frequencies of two other gene polymorphisms,rs2073618 and rs3102735,showed no statistical differences between patients and controls(P＞0.05).Furthermore,OPG serum levels in case group with TT,TC and CC genotypes in OPG rs2073617 polymorphism were markedly higher than those in control group(P＜0.05);while there were no statistical differences of OPG serum levels between controls and IDD patients who carried different genotypes in OPG rs2073618 and rs3102735 polymorphisms.The haplotype analysis showed that T-G-A haplotype associated with protection against IDD(OR=0.62,95%CI=0.41-0.94,P=0.02),while C-G-G haplotype associated with elevated susceptibility to IDD(OR=2.24,95%CI=1.09-4.60,P=0.02).Logistic-regression analysis indicated that low serum levels of OPG positively correlated with IDD risk,while the T-C-A,T-G-A and T-G-G haplotypes negatively correlated with IDD risk(P＜0.05).Conclusions OPG rs2073617 polymorphism is strongly connected with increased risk of IDD,but rs2073618 and rs3102735 might not be major risks of increasing IDD susceptibility.Low OPG serum level maybe increases IDD risk;By contrast,T-C-A,T-G-A and T-G-G haplotypes are protective factors for IDD probably.