寄生原蟲端粒蛋白研究進展

趙　娜，張西臣

(1. 華北理工大學實驗動物中心，河北唐山 063000；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062)

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寄生原蟲端粒蛋白研究進展

趙娜1,2，張西臣2*

(1. 華北理工大學實驗動物中心，河北唐山 063000；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062)

摘要：端粒蛋白是指那些直接或間接與端粒結合的蛋白組分。近年來寄生蟲端粒蛋白研究引起了人們廣泛的關注，為寄生蟲病的研究提供了新的思路。端粒蛋白具有維持染色體穩(wěn)定和細胞周期調控等多種功能，共同參與寄生蟲生命周期的調節(jié)，同時也為寄生蟲病的預防和治療開辟了新的途徑。論文主要綜述了包括TRFs、Rap1、TERT、RPA、Sir2和Orc1、Gbp、Ku、Rbp38以及LaTBP1等原蟲端粒蛋白及其功能，以期為尋找新的防治寄生蟲病的靶點提供借鑒。

關鍵詞：寄生蟲；端粒結合蛋白；端粒相關蛋白

端粒是真核細胞內線性染色體末端的一種富含G的短雙鏈串聯重復序列[1]。端粒蛋白通過與端粒DNA相互作用，調節(jié)端粒DNA長度和端粒酶活性、維持染色體穩(wěn)定，并與DNA復制、DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞凋亡及細胞的衰老和腫瘤有著極密切的聯系[2]。目前主要有3種形式的端粒蛋白,即單鏈DNA結合蛋白，雙鏈DNA結合蛋白和端粒相關蛋白。端粒結合蛋白直接保護端粒DNA，而端粒相關蛋白通過與端粒結合蛋白的相互作用間接影響端粒的功能。

寄生蟲端粒蛋白的發(fā)現為寄生蟲領域的研究開拓了更為廣闊的方向。寄生蟲端粒蛋白、端粒和端粒酶相互作用，共同完成對細胞生命活動的調節(jié)。同時，這將有助于了解寄生蟲基因表達和變異、細胞周期調節(jié)和基因重組等機制。展開和深入對該領域的研究，分離和鑒定寄生蟲端粒蛋白、尋找或設計針對該蛋白的藥物或疫苗為寄生蟲病的防治開辟了新的途徑。本文就寄生原蟲端粒蛋白的研究進展做一概述。

1端粒重復序列結合因子

端粒重復序列結合因子(TTAGGG repeat-binding factors, TRFs)包括TRF1和TRF2兩種蛋白復合物，其以同源二聚體的形式存在，兩者間并無相互作用。它們包含N端的Myb區(qū)和C端的TRFH區(qū)，識別端粒重復序列的雙鏈DNA區(qū)域，Myb區(qū)與端粒DNA重復序列結合[3]。

目前，在寄生蟲中研究該蛋白的主要有布氏錐蟲(T.brucei)和亞馬遜利什曼原蟲(L.amazonensis)。L.amazonensisTRF(LaTRF)分子質量為82.5 ku，是錐蟲TRF分子質量大小的2倍；其具有與哺乳動物TRFs類似的Myb和TRFH結構域。染色質免疫共沉淀試驗表明，LaTRF能在體內與端粒特異性的結合[4]。然而，LaTRF在端粒中的功能仍有待研究。T.bruceiTRF(TbTRF)是哺乳動物TRF2的同源物，但其缺少TRFH結構域，RNAi介導的TbTRF表達水平的降低導致細胞分裂的停滯以及端粒的縮短[5]。TbTRF在T.brucei可變表面糖蛋白(VSG)轉換中發(fā)揮關鍵作用，并且其與端粒DNA的結合活性影響著對VSG轉換的調節(jié)[6]。TbTRF的發(fā)現為研究端粒生物學功能以及T.brucei的致病機理提供了新的途徑。Jehi S E等[7]發(fā)現了一個新的端粒蛋白T.bruceiTRF互作因子2(TbTIF2)，并且功能研究表明該蛋白在錐蟲VSG轉換調節(jié)以及維持亞端粒結構的完整性和穩(wěn)定性方面具有重要作用。研究發(fā)現，TbTRF/TbTIF2作用的結構域是T.brucei特有的。因此，TbTRF/TbTIF2作用的結構域有可能成為研究抗寄生蟲藥物的一個潛在的靶點。

2抑制/激活蛋白

人抑制/激活蛋白(human repressor/activator protein,hRap1)是hTRF2互作蛋白，它通過與hTRF2形成復合物發(fā)揮端粒調節(jié)以及末端保護功能。hTRF2參與端粒以及非端粒DNA損傷應答，hRap1在這一過程中發(fā)揮著必不可少的作用[8]。T.bruceiRap1(TbRap1)也通過TbTRF與端粒DNA作用，在血液期的VSG表達沉默中發(fā)揮重要作用[9]。隨后，Pandya U M等[10]發(fā)現T.brucei在媒介昆蟲體內，TbRap1也能抑制VSG的表達，并參與染色質結構的調節(jié)。到目前為止，關于TbRap1的結構信息知之甚少，所以TbRap1與TbTRF的作用機制尚不能得到解釋。由于TbRap1獨特的與端粒DNA結合模式，其很可能與其他尚未得到鑒定的端粒蛋白作用而發(fā)揮功能。

3端粒酶逆轉錄酶

端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)最先在游仆蟲中被鑒定出來，隨后在人、鼠、酵母等分別被鑒定和克隆[11]。迄今先后報道了18種寄生蟲的TERT基因被克隆出來，包括藍氏賈第蟲、惡性瘧原蟲、微小隱孢子蟲、布氏錐蟲等[12]。同時發(fā)現不同真核生物TERT由很多高度保守的基序構成，TERT基因由3個結構域N端、反轉錄區(qū)(RT)和C端組成，TERT與端粒酶RNA共同參與染色體末端端粒重復序列的合成[13]。

研究發(fā)現,T.bruceiTERT(TbTERT)與其他真核生物的端粒酶具有相似的生物學活性。敲除TERT導致T.brucei每個分裂周期端粒長度縮短3 bp～6 bp[14]。通過轉錄活性和端粒沉默試驗研究端粒延伸機制，雖然端粒酶可能在T.brucei的染色體和微型染色體的有絲分裂中發(fā)揮與眾不同的作用，但其仍具有傳統(tǒng)的防止染色體末端融合和重排的作用。此外，Dreesen O等[14]推測T.bruceiTERT可能在VSG轉換中發(fā)揮作用，其具體機制仍需進一步研究。

4復制蛋白A

復制蛋白A(replication protein A, RPA)是一個高度保守的三聚體單鏈DNA結合蛋白，它參與DNA代謝的不同階段。目前鑒定的RPA同源物包括RPA1(70 ku)、RPA2(32 ku～34 ku)和RPA3(14 ku)[15]。在多數真核生物中，其通過OB折疊域與DNA結合。

在利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)中，RPA1具有標準的OB折疊域和一個縮短的RFA1結構區(qū)[16]。在L.amazonensis中，LaRPA1通過N-端OB折疊域與端粒G-rich鏈結合，證明了LaRPA1是L.amazonensis端粒相關核蛋白[16-17]。計算機模擬分析顯示LaRPA1的三級結構不同于人和酵母RPA1。功能試驗表明，LaRPA1能夠防止單鏈DNA的丟失，發(fā)揮對端粒的"蓋帽"功能[18]。結果分析顯示LaRPA1很可能是一個端粒末端結合蛋白，至于其他功能需要不斷地去探索。

5Sir 2和Orc 1

在瘧原蟲(P.falciparum)，Sir2是高度保守的端粒蛋白，包括Sir2A及其同源物Sir2B，其中Sir2A具有組蛋白其去乙酰化酶活性。研究表明，Sir2A缺失的P.falciparum具有更長的端粒重復序列，證明該蛋白在端粒末端保護中發(fā)揮著作用[19]。

Orc1作為DNA復制啟動蛋白，參與多種細胞活動，包括端粒生物學過程、姐妹染色單體粘連、基因沉默、著絲粒和中心體活性以及胞質分裂。研究發(fā)現，P.falciparumOrc1(PfOrc1) N端1 aa-238 aa能與端粒DNA在體外結合，內源性Orc1廣泛定位于端粒、亞端粒以及var啟動子區(qū)域；Orc1與Sir2共同定位于端粒區(qū)，Orc1與Sir2協同作用抑制var家族的基因表達[20-21]。鑒于var基因家族編碼的產物在P.falciparum致病和免疫逃避過程中有重要作用，Orc1可能是探究P.falciparum致病性的新靶點。在T.brucei中，TbOrc1也是一個端粒相關蛋白，定位于亞端粒區(qū)，其調控VSG的表達和轉換[22]。

6Gbp

Liu C等[23]在微小隱孢子蟲(C.parvum)中發(fā)現了一個端粒結合蛋白CpGbp(約23 ku)，含有兩個RNA識別基序(RRMs)，其與單鏈G鏈端粒DNA結合，與萊茵衣藻的Gbp1p具有很高的同源性。該蛋白是一個核蛋白，與其潛在的調節(jié)端粒長度的特性相一致。同時，在柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)中也發(fā)現了該蛋白的同源物EtGbp1p，研究證明其是一個端粒結合蛋白[24]。由于復雜的生活史以及體外培養(yǎng)技術的局限，C.parvum和E.tenella細胞和分子生物學特性的研究相對滯后，該蛋白的發(fā)現為深入研究二者的細胞和分子生物學特性以及生命周期調節(jié)提供了新的方向。

7其他端粒蛋白

Ku是由分子質量各為70 ku和80 ku的蛋白亞基組成的異源二聚體，其具有修補斷裂的雙鏈DNA和維持端粒長度的作用，同時參與DNA重組、基因沉默。T.bruceiKu表現出參與端粒長度維持的功能，但是對DNA雙鏈損傷修復沒有明顯的作用。同時Ku的缺失以及導致的端粒漸進性縮短都沒有對VSG轉換和VSG表達位點的沉默產生影響[25]。

對于錐蟲屬來說，Rbp38是一個獨特的蛋白，它不含有任何保守域。在L.tarentolae和T.brucei中，Rbp38是一個RNA結合蛋白，具有穩(wěn)定線粒體RNA的功能并參與動基體DNA的復制[26]。研究表明LaRbp38是一個38 ku的端粒DNA結合蛋白，染色質免疫共沉淀試驗證明了其能與動基體DNA和核DNA結合[27]。這提示了LaRbp可能具有多重生物學功能，為藥物研發(fā)提供了靶標。

LaTBP1是L.amazonensisDNA結合蛋白，能特異的結合雙鏈端粒DNA和GT-rich區(qū)。LaTBP1有一個Myb樣DNA結合域，在結合域中存在一個保守的疏水區(qū)，該疏水區(qū)與該蛋白結合DNA的活性有關[28]。

8 展望

隨著對端粒蛋白這一領域的深入研究，我們對端粒蛋白和端粒及它們所形成的端粒末端復合物的結構和功能逐漸清晰起來。寄生蟲作為自然界中一大類生物，端粒蛋白和端粒在其基因表達、細胞周期調控、基因重組和完成生活史方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，寄生蟲端粒蛋白的研究處于相對滯后的狀態(tài)，僅在幾種原蟲中有所研究，而且研究方向多限于端粒蛋白的鑒定和結構的分析。對于寄生蟲端粒蛋白的功能和作用原理，目前我們所能獲取的信息相對較少，阻礙了對于寄生蟲更深層次的認識，同時很難將其應用到寄生蟲病的防治中去。因此，寄生蟲端粒蛋白的功能研究應該成為該領域研究的重要方向，以便人們更深刻和多角度了解寄生蟲，防治寄生蟲病。

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Advance in Telomeric Proteins of Parasitic Protozoa

ZHAO Na1,2, ZHANG Xi-chen2

(1.LaboratoryAnimalCenter,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei,063000,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin，130062,China)

Abstract:Telomere proteins are integral components of the telomere complex that bind directly or indirectly with telomere DNA. The telomeric proteins that provide a new research area on parasites, have been paid a great attention recently. They play important roles in both chromosome stability and the regulation of life cycle in parasites. Furthermore, the researches on telomeric proteins opens exciting avenues on the prevention and treatment of parasitic diseases. This article reviewed telomeric proteins of protozoa and related functions, including TRFs, Rap1, TERT, RPA, Sir2, Orc1, Gbp, Ku, Rbp38, and LaTBP1, to develop novel targets for anti-parasite agents.

Key words:parasite; telomere-binding protein; telomere-associated protein

收稿日期：2015-11-29

基金項目：國家自然科學基金項目(31272550，30970322)

作者簡介：趙娜(1986-)，女，河北唐山人，講師，博士，主要從事動物及人獸共患寄生蟲病研究。 *通訊作者

中圖分類號:S852.7

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0102-04