人臍帶間充質干細胞釋放膜微囊相對理想條件的體外實驗研究

金鑫，吳波，畢曉云，陳晶礪，盧懷筍，鐘轉弟，溫麗娟

（1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510730；2.廣東省江門中醫(yī)藥學校，廣東 江門 529000）

人臍帶間充質干細胞釋放膜微囊相對理想條件的體外實驗研究

金鑫1，吳波2，畢曉云1，陳晶礪1，盧懷筍2，鐘轉弟1，溫麗娟1

（1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510730；2.廣東省江門中醫(yī)藥學校，廣東 江門 529000）

目的 通過體外實驗考察人臍帶間充質干細胞釋放膜微囊的相對理想條件。方法將人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)5代后，再以血清和低氧為交互培養(yǎng)條件，分別進行有血清-常氧(Norm)、無血清-常氧(SF)、有血清-低氧（Hypo）及無血清-低氧(Hypo-SF)四種不同條件下的72 h培養(yǎng)，最后收集膜微囊進行觀察鑒定，同時采用流式細胞術分析膜微囊表面分子表達及蛋白定量。結果透射電子顯微鏡觀察結果顯示，不同培養(yǎng)條件下的樣本照相均有觀察到膜狀結構，且其中心呈低密度區(qū)，多數膜結構直徑不超過100 nm，部分發(fā)生聚集，整體形態(tài)學特征符合膜微囊特點；流式細胞術分析膜微囊的表面標記與來源細胞人臍帶間充質干細胞相似，二者均表達CD29、CD44、CD73及CD105，對CD31及CD45不表達，提示該膜微囊為來源于人臍帶間充質干細胞；收獲細胞數分別為Norm培養(yǎng)：(1.63±0.28)×108個，SF培養(yǎng)：(0.72±0.25)×108個，Hypo培養(yǎng)：(2.32±0.34)×108個，Hypo-SF培養(yǎng)：(1.48±0.33)×108個，Hypo培養(yǎng)顯著高于Norm、SF、Hypo-SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.367、6.925、4.216，P＜0.05)，Hypo-SF顯著高于SF培養(yǎng)(t=2.917，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，Norm培養(yǎng)與Hypo-SF培養(yǎng)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.827，P＞0.05)。膜微囊蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，相同細胞數量所產生的膜微囊蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)。結論低氧是促進人臍帶間充質干細胞釋放膜微囊相對更為理想的條件之一，同時建議采用低氧條件下的無血清培養(yǎng)。

人臍帶間充質干細胞；膜微囊；釋放；條件；體外實驗

間充質干細胞(Mesenchymal stromal cell，MSC)為一類成體干細胞總稱，此類細胞不僅具有較強的體外增殖能力及調節(jié)多種免疫細胞功能的作用，還具備成脂細胞和成軟骨細胞等多種細胞分化的功能[1]。目前MSC已獲得初步應用，且進展順利[2-3]。同時大量研究業(yè)已證實[4-6]，MSC還具有頗強的促血管再生作用，這進一步為心肌梗死與外周血管病的臨床治療指出了新的方向。稍早期的一些研究指出，MSC促血管再生的主要機制是基于其所具有的旁分泌作用[7]，但新近的體外實驗研究發(fā)現，由MSC所釋放的膜微囊(Microvesicles，MV)在體外可顯著增強血管內皮細胞的增殖能力，故推測其可對機體內已發(fā)生損傷的血管具修復作用[8]。人臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stromal cell，hUC-MSC)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，其兼具有易于大量獲取、免疫原性低以及可在不加用免疫抑制劑的情況下長期存活等諸多優(yōu)勢，較其他種類MSC更具臨床開發(fā)前景[9]。本研究對hUC-MSC釋放MV的相對理想條件進行了體外實驗探索，旨在為后續(xù)臨床應用hUC-MSC-MV開展外周血管病等疾病的治療提供理論基礎，報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集 本研究臍帶標本均取自健康足月順產的新生兒，共5份，由筆者所在醫(yī)院產科提供。產婦及其家屬對本研究均知情同意，符合醫(yī)院倫理委員會制定的人標本實驗應用規(guī)范。

1.1.2 試驗設備及試劑 人臍帶MSC培養(yǎng)用胎牛血清(購自Stemcell公司)；alpha-MEM培養(yǎng)液(購自維森特生物技術有限公司)；磷酸緩沖液PBS(自制)；2-嗎啉乙磺酸生物緩沖液MES(自制)；透射電子顯微鏡(H-7650型，購自日立公司)；Optima L-100XP型超速離心機(Beckman Coulter公司)；乙酰化乳膠珠(Invitrogen公司)；PE標記的小鼠抗人CD29、CD31、CD44、CD45、CD73及CD105單克隆抗體(SEROTEC公司)。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶MSC的培養(yǎng)及鑒定 參考徐燕等[10]文獻資料進行人臍帶MSC培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中對全部標本細胞進行形態(tài)學觀察、表明標記檢測及分化能力鑒定，所獲細胞均符合人MSC特征[11]。將細胞培養(yǎng)5代后再開展后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞預處理 先將MSC懸浮于Alpha-MEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液分含或不含10%胎牛血清兩種，接著分別接種到150 mm的培養(yǎng)皿中，每皿含細胞2×106個，以血清和低氧(1.0%)為交互培養(yǎng)條件，將接種后的培養(yǎng)皿各20份樣本分別放置到有血清-常氧(Norm)、有血清-低氧(Hypo)、無血清-常氧(SF)及無血清-低氧(Hypo-SF)四種不同條件下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

1.2.3 收集MV并觀察鑒定 采用胰蛋白酶消化貼壁細胞，活細胞采用臺盼藍拒染法計數。收集培養(yǎng)上清液離心處理，2 000×g離心10 min將細胞碎片去除，接著以0.45 μm濾膜過濾。再將上清液以100 000×g離心處理2 h，并采用PBS將獲得的沉淀物(MV)洗滌2 h，再接著向其加入緩沖液(含KCl為5 mmol/L，MgCl2為1 mmol/L，NaCl為136 mmol/L)，混勻后以每管50 μL分裝至Ultra-Clear離心管中，放置到-80℃冰箱中并采用透射電子顯微鏡對hUC-MSC-MV的形態(tài)特征進行逐一觀察鑒定，同時放大10 000倍照相。

1.2.4 hUC-MSC-MV的表面分子表達及蛋白定量分析 參照文獻[12]方法進行表型標記分析。將MV懸液加入到懸浮有直徑3.9 μm乙?；槟z珠的MES緩沖液中，在4℃環(huán)境中反應并過夜，次日將乳膠珠洗滌去除，分別加入各單克隆抗體后室溫下避光反應20 min。再次PBS洗滌，流式細胞儀收集數據，采用WinMdi 2.9軟件對收集到的數據資料進行分析，以代表單個及兩個珠子聚合的點數據設門，分析相對熒光強度。用牛血清白蛋白標準品制備標準曲線采用Bradford法測定蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件包對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗，取檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MV的形態(tài)學特征及鑒定 透射電子顯微鏡觀察結果顯示，不同培養(yǎng)條件下的樣本照相均有觀察到膜狀結構，且其中心呈低密度區(qū)，多數膜結構直徑不超過100 nm，部分發(fā)生聚集，整體形態(tài)學特征符合膜微囊特點[13]，見圖1。

圖1 10 000倍hUC-MSC-MV電子顯微鏡下的形態(tài)特征

2.2 MV攜帶MSC表型標記分析結果 MV的表面標記與來源細胞hUC-MSC相似，二者均表達CD29、CD44、CD73及CD105，對CD31及CD45不表達，見圖2。說明該MV為來源于hUC-MSC，為hUC-MSC-MV。

2.3 不同培養(yǎng)條件下的hUC-MSC細胞計數及MV蛋白總量比較 結果顯示，收獲細胞數分別為Norm培養(yǎng)：(1.63±0.28)×108個，SF培養(yǎng)：(0.72±0.25)× 108個，Hypo培養(yǎng)：(2.32±0.34)×108個，Hypo-SF培養(yǎng)：(1.48±0.33)×108個，Hypo培養(yǎng)顯著高于Norm、SF、Hypo-SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.367，6.925，4.216，P＜0.05)，Hypo-SF顯著高于SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.917，P＜0.05)，Norm培養(yǎng)與Hypo-SF培養(yǎng)，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.827，P＞0.05)；MV蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)；將收獲細胞數與MV蛋白總量相結合進行比較發(fā)現，相同細胞數量所產生的MV蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)(圖3)。

圖2 MV攜帶MSC表型標記分析

圖3 hUC-MSC收獲的細胞數

3 討 論

MV為一種膜狀結構。由多種細胞在激活、增殖甚至靜息狀態(tài)下釋放，可作為細胞間相互作用的重要介質[14-16]。研究認為，MSC具有促血管再生功能，而該功能并非源于細胞的直接分化作用，而應主要歸功于其所產生的MV[17]。然而，目前對通過體外培養(yǎng)MSC來產生MV的實驗條件尚未形成統(tǒng)一認識。

本研究發(fā)現，MV蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，其中Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)的MV蛋白總量高于SF培養(yǎng)和Norm培養(yǎng)，該結果提示低氧可促進MSC釋放MV。但低氧促進MSC釋放MV的機制，至今尚未闡明。但從已開展的相關研究中可窺見一二。如有研究顯示，低氧對骨髓及臍帶MSC的增殖具有促進作用[18]，細胞在增殖或被激活過程中會釋放MV，低氧條件下，細胞較強的增殖能力也可致使MSC釋放MV。本研究結果顯示，Norm培養(yǎng)(1.63±0.28)×108個，SF培養(yǎng)(0.72±0.25)× 108個，Hypo培養(yǎng)(2.32±0.34)×108個，Hypo-SF培養(yǎng)(1.48±0.33)×108個，Hypo和Hypo-SF培養(yǎng)數顯著高Norm、SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義，與相關研究相符。證實了低氧有助于骨髓及臍帶MSC的增殖。

臍帶MSC在低氧刺激48 h后即可在mRNA水平高表達低氧誘導因子(HIF)[19]。刺激持續(xù)72 h，MSC高表達HIF蛋白分子以及與能量代謝相關的分子，如乳酸脫氫酶和葡萄糖轉移酶-1等。HIF是血管內皮生長因子(VEGF)及促紅細胞生成素(EPO)的關鍵調控因子，它們是低氧刺激下細胞主要的反應因子，與血管新生密切相關[20]。此外，我們在研究中進一步將收獲細胞數與MV蛋白總量相結合進行比較發(fā)現，相同細胞數量所產生的MV蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，Hypo-SF培養(yǎng)與其他三種培養(yǎng)比較以及Hypo培養(yǎng)與后兩者比較均有顯著性差異，提示無血清培養(yǎng)也可增加MSC釋放MV的量。其具體機制目前未見報道，有待進一步研究。但我們可以肯定的是，在加用血清進行培養(yǎng)后，為確保后續(xù)實驗的可靠性，我們還必須將血清離心清除，而這個過程也難免不會對MV造成干擾。同時血清本身還可能存在有病毒活性及其他未知微生物，不僅可混雜于MV中而影響相關檢測，而且也在一定程度上增加了研究者及臨床試驗者的感染風險。故總體來看，完全沒必要將血清納入hUC-MSC體外培養(yǎng)釋放MV的培養(yǎng)基質材料，甚至不用的益處更多。

總之，本次體外實驗結果提示，低氧是促進hUC-MSC釋放MV相對更為理想的條件之一，這可為臨床應用hUC-MSC-MV開展外周血管病等疾病的治療提供理論基礎。然而，低氧促進hUC-MSC釋放MV的具體機制，改變條件所生產的MV所攜帶的活性物質是否也同時具有某些質的差異，仍有待進一步探索闡明。

[1]Bianco P,Cao X,Frenette PS,et al.The meaning,the sense and the significance:translating the science of mesenchymal stem cells into medicine[J].Nat Med,2013,19(1):35-42.

[2]馬錫慧,肖漓,石炳毅.間充質干細胞免疫抑制作用及其在移植免疫中應用的研究進展[J].中華細胞與干細胞雜志,2015,5(1): 46-51.

[3]侯威宇,程艷偉,向川.間充質干細胞源性微囊泡和誘導性多潛能干細胞促進關節(jié)軟骨修復的進展[J].中國組織工程研究,2015,19 (41):6706-6710.

[4]Paul D,Samuel SM,Maulik N.Mesenchymal stem cell:present challenges and prospective cellular cardiomyoplasty approaches for myocardial regeneration [J].Antioxid Redox Signal,2009,11(8): 1841-1855.

[5]Choi YH,Kurtz A,Stamm C.Mesenchymal stem cells for cardiac cell therapy[J].Hum Gene Ther,2011,22(1):3-17.

[6]Williams AR,Hare JM.Mesenchymal stem cells:biology,pathophysiology,translational findings,and therapeutic implications for cardiac disease[J].Circ Res,2011,109(8):923-940.

[7]Mummery CL,Davis RP,Krieger JE.Challenges in using stem cells for cardiac repair[J].Sci Transl Med,2010,2(27):27-30.

[8]馮文磊,張猛,徐芳潔,等.共培養(yǎng)體系間充質干細胞對同源內皮祖細胞增殖和血管形成的影響[J].醫(yī)學研究生學報,2015,28(3): 229-235.

[9]Choumerianou DM,Martimianaki G,Stiakaki E,et al.Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults[J].Cytotherapy,2010,12(7):881-887.

[10]徐燕,李長虹,孟恒星,等.人臍帶間充質干細胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學特性[J].中國組織工程研究與臨床康復,2014,13 (32):6289-6294.

[11]Jin JD,Wang HX,Xiao FJ,et al.A novel rich source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow samples[J]. Biochem Biophys Res Commun,2008,376(1):191-195.

[12]Zhang HC,Liu XB,Huang S,et al.Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo[J].Stem Cells Dev, 2012,21(18):3289-3297.

[13]Combes V,AC Simon,GE Grau,et al.In vitro generation of endothelial microparticles and possible prothrombotic activity in patients with lupus anticoagulant[J].J Clin Invest,1999,104(1):93-102.

[14]裴杰,郭憲,張林,等.質膜微囊蛋白3的功能與相關疾病研究進展[J].蘭州大學學報：自然科學版,2015,51(5):716-722.

[15]劉柏炎,俞悅,易健,等.細胞質膜微囊蛋白1敲除小鼠神經干細胞培養(yǎng)與生物學特性[J].中國組織工程研究,2014,18(23):716-722.

[16]洪勉名,陳建英.間充質干細胞來源膜微囊轉運蛋白減輕心肌缺血再灌注損傷的研究進展[J].現代醫(yī)藥衛(wèi)生,2014,30(12): 1807-1809.

[17]Wu S,Ju GQ,Du T,et al.Microvesicles derived from human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells attenuate bladder tumor cell growth in vitro and in vivo[J].PLoS One,2013,8(4): e61366.

[18]Hung SP,Ho JH.Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potentials of human mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res,2012,30(2):260-266.

[19]Lavrentieva A,Majore I,Kasper C,et al.Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells [J].Cell Commun Signal,2010,89(1):18-27.

[20]Svensson KJ,Kucharzewska P,Christianson HC,et al.Hypoxia triggers a proangiogenic pathway involving cancer cell microvesicles and PAR-2-mediated heparin-binding EGF signaling in endothelial cells[J].Proc NatlAcad Sci USA,2011,108(32):13147-13152.

In vitro study of the relatively ideal conditions for the release of microvesicles in human umbilical cord mesenchymal stromal cell.

JIN Xin1,WU Bo2,BI Xiao-yun1,CHEN Jing-li1,LU Huai-sun2,ZHONG Zhuan-di1,WEN Li-juan1.1.Department of Clinical Laboratory,the Development District People's Hospital of Guangzhou,Guangzhou 510730, Guangdong,CHINA;2.The School of Traditional Chinese Medicine of Jiangmen City,Jiangmen 529000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the relatively ideal conditions for the release of microvesicles(MV)in human umbilical cord mesenchymal stromal cell(hUC-MSC)through in vitro experiments.MethodsAfter cultivation for 5 generations,the hUC-MSCs were cultured for 72 h,with serum and hypoxia as culture conditions for interaction,under four different conditions:serum and normoxia(Norm),serum-free and normoxia(SF),serum and hypoxia(Hypo), serum-free and hypoxia(Hypo-SF).MV were collected for identification and observation,and molecule expression and protein quantitation on MV surface were determined by flow cytometric analysis.ResultsTransmission electron microscopy(TEM)observation showed that membrane structure was observed in the sample under different culture conditions.The structure showed low density in the center and had a diameter of less than 100 nm mostly,with partial aggregation,whose overall morphology was found in accordance with the characteristics of MV.Flow cytometric analysis revealed that surface markers of the membrane were similar with the source hUC-MSC,which both expressed CD29, CD44,CD105,CD73,and did not express CD31 and CD45,indicating that the membrane was derived from hUC-MSC. The number of harvested cells was(1.63±0.28)×108for Norm culture,(0.72±0.25)×108for SF culture,(2.32±0.34)×108for Hypo culture,and(1.48±0.33)×108for Hypo-SF culture,which was significantly higher in Hypo culture than Norm, SF,Hypo-SF culture(t=3.367,6.925,3.367,P＜0.05),as well as in Hypo-SF culture than SF culture(t=2.917,P＜0.05), with no significant difference between Norm culture and Hypo-SF culture(t=0.827,P＞0.05).The total amount of MV protein from high to low was in the order of Hypo culture,Hypo-SF culture,SF culture,and Norm culture,and the MV protein produced by the same amount of cells from high to low was in the order of Hypo-SF culture,Hypo culture,SF culture,Norm culture.ConclusionHypoxia is one of the relatively desirable conditions to promote the release of MV in hUC-MSC,and the use of serum-free culture under hypoxic conditions is recommended.

Human umbilical cord mesenchymal stromal cell(hUC-MSC);Microvesicles(MV);Release;Conditions;In vitro

R329.2+7

A

1003—6350（2016）12—1896—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.002

2016-02-28)

廣東省江門市科技計劃項目（編號：20150020003139）

金鑫。E-mail：657237479@qq.com