水牛精液冷凍稀釋液研究現(xiàn)狀

付　平，張力青，郭妮妮，易四鳳，全凡凡（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢430070）

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水牛精液冷凍稀釋液研究現(xiàn)狀

付平，張力青，郭妮妮，易四鳳，全凡凡
（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢430070）

摘要：牛的精液冷凍保存技術(shù)已較成熟，其商品化的精液冷凍稀釋液也很多，而水牛的精液稀釋液大多還是沿用奶牛和黃牛的，但是近年來關(guān)于水牛精液冷凍稀釋液的研究也逐漸開展。文章對最新水牛的精液冷凍稀釋液成分的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，期望在實(shí)際生產(chǎn)中對水牛精液的冷凍保存提供一些參考。

關(guān)鍵詞：水牛；精液；冷凍稀釋液

自從1949年發(fā)現(xiàn)甘油在雞精液的冷凍-解凍過程中的保護(hù)作用，家畜精液冷凍保存技術(shù)得到了飛速發(fā)展，牛的冷凍稀釋液的研究業(yè)已成熟，其商品化的精液冷凍稀釋液也多起來[1]。但是針對水牛的精液冷凍稀釋液研究較少，主要集中于印度和巴基斯坦等水牛數(shù)量相對較多的國家，我國關(guān)于水牛稀釋液的研究及應(yīng)用基本集中在南方幾個(gè)省份：廣西、湖南、湖北、四川、云南等地。文章通過分析水牛精液冷凍稀釋液的成分，為水牛精液的冷凍保存提供參考。

1　營養(yǎng)成分

營養(yǎng)物質(zhì)主要是給牛精子提供外源性的營養(yǎng)和能量，以延長精子的壽命。由于牛精子的代謝過程只是簡單的分解作用，不能利用復(fù)雜的合成作用將外源物質(zhì)轉(zhuǎn)變其自身成分，所以稀釋液中的營養(yǎng)成分必須是最簡單的能源物質(zhì)。現(xiàn)在奶牛精液稀釋液中一般添加葡萄糖、果糖、蔗糖、雞卵黃、奶類等，水牛稀釋液基本上參照奶牛，但是近年來在水牛上也有不少關(guān)于應(yīng)用其他物質(zhì)代替單糖類、雞卵黃的研究。易康樂在水牛精液冷凍稀釋液中分別添加鵪鶉卵黃和雞卵黃，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：稀釋液中添加鵪鶉卵黃的水牛精子解凍后其活力、分裂率和囊胚孵化率都顯著優(yōu)于雞卵黃組（＜0.05）[2]。近年來因卵黃內(nèi)可能攜帶病原菌的隱患，現(xiàn)國外生產(chǎn)的一些稀釋液中采用大豆卵磷脂代替卵黃。Akhter等在水牛精液稀釋液中分別添加5.0％、10％、15％的大豆卵磷脂和20％的雞卵黃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛精液冷凍-解凍后添加的10％大豆卵磷脂精子受胎率顯著高于添加20％的卵黃組（≤0.05）。金海關(guān)于無動物源性水牛精液冷凍稀釋液的研究中，用大豆卵磷脂代替卵黃，發(fā)現(xiàn)3％大豆卵磷脂的冷凍精子的運(yùn)動速度比卵黃稀釋液解凍后的差異顯著，其他方面與卵黃稀釋液沒有明顯差異。

2　緩沖和維持滲透壓成分

公牛體內(nèi)精液微環(huán)境的pH值一般在6.4～7.8之間，精液的pH值和稀釋液的pH值的變化，將直接影響到精子的活力。精液冷凍保存時(shí)，在稀釋液中添加適量的緩沖物質(zhì)，如檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉等，這些弱酸鹽類在溶液中能夠維持酸堿平衡，從而有利于精子存活。在牛精液冷凍稀釋液中常用磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris或者幾種鹽類組合來調(diào)節(jié)pH值。易康樂比較了TRIS、TEST、EYC三種不同的緩沖液對凍后水牛精子的影響，結(jié)果表明這三種緩沖液都能用于水牛凍精生產(chǎn)，但Tris和Tes這兩種緩沖成分對水牛精子的保護(hù)作用更明顯［2］。國外許多學(xué)者在水牛稀釋液的研究中大多都以Tris-檸檬酸鈉-卵黃作為基礎(chǔ)液，Tris-檸檬酸鈉緩沖體系能夠調(diào)節(jié)精液的pH值，維持精液酸堿平衡，從而延長家畜精子的存活時(shí)間[3]。

一般認(rèn)為精子周圍的微環(huán)境基本上是等滲的，如果精子生存的液體環(huán)境滲透壓升高將會導(dǎo)致精子內(nèi)部脫水；如果其液體環(huán)境滲透壓過低則將會導(dǎo)致精子膨脹進(jìn)而死亡，所以維持精子微環(huán)境一定的滲透壓是十分重要的。調(diào)節(jié)pH值的緩沖鹽類和糖類對精液的滲透壓維持具有重要作用，Chaveiro等研究表明，在公牛精液中添加Tris和蔗糖的稀釋液維持滲透壓效果比較理想。但是某些電解質(zhì)或非電解質(zhì)會破壞精子的等滲壓環(huán)境，對精子產(chǎn)生刺激和損傷，例如添加甘油的稀釋液會使精液滲透壓升高，進(jìn)而因高滲沖擊使精子受損，水牛精子相對黃牛來說抵抗力較差，體外存活時(shí)間短，對緩沖和維持滲透壓物質(zhì)要求相對要高，但當(dāng)前針對水牛精液的特點(diǎn)研發(fā)的稀釋液配方較少。

3　抗凍和防休克成分

精液在體外冷凍保存時(shí)，需要由常溫降至零度以下，溫度驟降形成的冷刺激或者物態(tài)變化，將會使精子遭受冷休克或凍害而死亡，因此稀釋液中添加的抗凍或防休克物質(zhì)能夠保護(hù)精子在溫度驟降過程中不受損害。稀釋液中添加的卵黃就具有防凍和冷休克的作用，許多研究表明，卵黃因其含有卵磷脂或者LDL（低密度脂蛋白）等物質(zhì)所以可以保護(hù)精子頂體和質(zhì)膜的完整性，從而防止精子冷凍或冷休克的發(fā)生。近年來，關(guān)于利用LDL來取代卵黃的報(bào)道也有不少。胡建宏等研究報(bào)道，牛精液稀釋液中用8％LDL取代20％雞蛋黃，其精子凍后活力、運(yùn)動等方面效果明顯提高。Akhter等將尼里水牛的精液用含有LDL的稀釋液稀釋，添加20％雞蛋黃的稀釋液作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加10％LDL的水牛精子解凍后的活力、質(zhì)膜完整性和受胎率均顯著高于20％的卵黃對照組[4]。

精液冷凍稀釋液中最常用的防凍劑是甘油，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為甘油是目前稀釋液中抗凍效果最好的，但是甘油的添加量必須適中，太少不能起到保護(hù)作用，太多容易造成精子滲透性損傷或使精子中毒。張鵬等研究報(bào)道，荷斯坦種公牛稀釋液中添加4％的甘油濃度對精子凍后活率和頂體完整性效果最好?？紤]到甘油對精子的毒性，一些研究中用乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜等來代替甘油，效果不盡相同。Rasul等將甘油和二甲亞砜按不同的比例添加到尼里水牛精液的稀釋液中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅添加6％甘油的水牛精子解凍后其活力和質(zhì)膜完整性效果最好，二甲亞砜反而會降低甘油對水牛的冷凍保存效果。

4　抗菌成分

精液如果被微生物污染會導(dǎo)致精子活力降低，存活時(shí)間縮短，并且人工授精后極易造成胚胎的早期死亡，從而使牛受胎率降低，所以在牛冷凍精液生產(chǎn)過程中必須控制凍精的細(xì)菌含量不超標(biāo)。牛凍精稀釋液中一般添加如青霉素、鏈霉素等抗生素來抑制精液中細(xì)菌的生長。由于精液中微生物的種類很多，若使用單一的抗生素則不能達(dá)到抑菌的效果，因此現(xiàn)在稀釋液中常用的是各種抗生素的組合，目前水牛中常用的是青-鏈霉素組合。Hasan等研究報(bào)道，水牛精液稀釋液中添加慶大霉素-泰樂菌素-林可霉素-壯觀霉素（GTLS）抗生素組合，其細(xì)菌數(shù)要明顯比青-鏈霉素組的低。易康樂等研究報(bào)道，GTLS抗生素組合抑菌效果顯著好于青-鏈霉素組和青-新霉素組。金海使用不同濃度的GTLS抗生素組合代替青-鏈霉素，結(jié)果證實(shí)×1倍的GTLS抗生素組合效果最好。

5　抗氧化成分

在冷凍-解凍的有氧環(huán)境中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會產(chǎn)生過多的活性氧成分，從而增加了受損精子和死亡精子的數(shù)量，導(dǎo)致凍后精液質(zhì)量的下降。在稀釋液中添加抗氧化物質(zhì)可以提高精子抗過氧化損害的能力，防止解凍后精液質(zhì)量下降，目前牛稀釋液中常添加維生素類、酶類等抗氧化成分。易康樂等在水牛精液冷凍稀釋液中添加不同的維生素組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 ml/100 ml的復(fù)合VB、2 mg/L的VB12和1.0 mg/L VC能較顯著提高水牛凍精的活力（＜0.05）。雷虹等研究也證實(shí)添加的3 mL/100mL復(fù)合VB可以提高解凍后水牛精子的活力和頂體完整率。易康樂在水牛精液稀釋液中添加SOD和GSH，發(fā)現(xiàn)它們可以顯著延長水牛精子的存活時(shí)間。

6　其他

為了改善家畜精子生存環(huán)境的理化特性，減輕精子冷凍-解凍過程的各種損害，牛精液冷凍稀釋液中常常還加入一些酶類、維生素、激素類及其他物質(zhì)，以提高精子復(fù)蘇后的活力、保持頂體的完整性等，從而增強(qiáng)牛精子在人工授精時(shí)的受精能力。近年來水牛精液稀釋液中也有相關(guān)添加其他物質(zhì)的報(bào)道。Dorostkar等人將不同濃度的硫酸鋅添加到水牛稀釋液中，結(jié)果表明，0.288 mg/L的硫酸鋅對水牛精子的冷凍保存效果和抗氧化能力較好。Qadeer等將AFGP（抗凍糖蛋白）添加到尼里水牛精液的稀釋液中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精液冷凍-解凍后水牛的精子活力和質(zhì)膜完整性有了顯著提高。

雖然牛精液冷凍稀釋液的成分和生產(chǎn)工藝業(yè)已成熟，但是如何根據(jù)不同種類的公牛精液的理化特點(diǎn)，設(shè)計(jì)適合該類種公牛的精液冷凍稀釋液，仍是今后牛精液冷凍保存技術(shù)中需要克服的一個(gè)重要難題。

參考文獻(xiàn)：

［1］潘紅梅,羅敏,王可甜,等.畜禽精液冷凍稀釋液主要成分的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010,（01）：21-22.

［2］易康樂.水牛冷凍精液稀釋液配方改進(jìn)的研究[D].南寧：廣西大學(xué),2005.

［3］Andrabi SM1,Ansari MS,Ullah N,et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa[J].Anim Reprod Sci.2008,104(2-4):427-433.

［4］Akhter S,Ansari MS,Andrabi SM.Soya-lecithinin extender improves the freezability and fertility of buffalo (Bubalus bubalis)bullspermatozoa.Reprod Domest Anim.，2012，47(5):815-819.

作者簡介：付平（1979-），女，湖北南漳人，畜牧師，主要從事家畜繁育工作。

中圖分類號：S823

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006－799X（2016）01-0008-02