睪丸特異性蛋白50在腫瘤中的研究進(jìn)展

郭秋實(shí)，李冰潔 綜述，朱　濤△ 審校

(1.河南省柘城縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南商丘 476200；2.河南省平頂山學(xué)院　467000)

·綜述·

睪丸特異性蛋白50在腫瘤中的研究進(jìn)展

郭秋實(shí)1，李冰潔2綜述，朱濤1△審校

(1.河南省柘城縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南商丘 476200；2.河南省平頂山學(xué)院467000)

關(guān)鍵詞:睪丸特異性蛋白50；乳腺癌；胃癌；結(jié)直腸癌；腫瘤標(biāo)記

睪丸特異性蛋白50(TSP50)是利用甲基化敏感差分析技術(shù)(MS-RDA)從睪丸組織和乳腺癌組織中分離出來的低甲基化片段，其表達(dá)具有高度的特異性，在人睪丸組織中特異性高表達(dá)；肺臟、胃腸道、乳腺等正常組織均不表達(dá)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),TSP50在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),有望作為一種潛在的新型腫瘤標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床腫瘤的診斷和治療，成為腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。

1TSP50概述

1.1TSP50的理化特性TSP50是腫瘤/睪丸抗原(CTA)家族中的一個(gè)新成員，Shan等[1]以乳腺癌組織為材料，用對甲基化CG 豐富序列敏感的限制性核酸內(nèi)切酶MSPⅠ來消化基因組 DNA 制備復(fù)制子，再通過MS-RDA在乳腺癌組織基因組中分離得到2個(gè)亞甲基化DNA片段(BR50、BR254)，再用BR50作為探針，在人體睪丸cDNA文庫里篩選到一種新的腫瘤-睪丸基因。正常情況下，TSP50在人睪丸組織中特異性高表達(dá),肺臟、胃腸道、乳腺等組織均不表達(dá)[2]。TSP50編碼基因位于人類第3號染色體上，cDNA全長1 338 bp，含有4個(gè)外顯子，編碼一種含385個(gè)氨基酸的蛋白，其與常見的絲氨酸蛋白酶同源,但催化活性中心三聯(lián)體結(jié)構(gòu)中的絲氨酸被蘇氨酸替換，因此它是一個(gè)特殊類型的蘇氨酸蛋白酶，且蘇氨酸蛋白酶活性殘基在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[3]。TSP50基因有活性的啟動(dòng)子包含CpG島和轉(zhuǎn)錄活性區(qū),人DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的片段為-89～-257,長度為168 bp,這個(gè)CpG島包括12個(gè)CG和TATA盒子[4]。

1.2TSP50蛋白在腫瘤中的表達(dá)與調(diào)控TSP50蛋白表達(dá)具有高度的特異性，其可能與TSP50 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化水平有關(guān)。Huang等[4]的研究指出，正常組織中 TSP50 啟動(dòng)子 CpG 島甲基化位點(diǎn)處于髙甲基化狀態(tài)，結(jié)合的甲基改變了 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象，影響了某些表達(dá)調(diào)控因子與 TSP50 啟動(dòng)子的結(jié)合，TSP50 啟動(dòng)子的活性降低，TSP50 基因功能保持沉默，TSP50 蛋白不表達(dá)。腫瘤組織因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化位點(diǎn)去甲基化，DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象發(fā)生了改變，使某些表達(dá)調(diào)控因子能夠與TSP50啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)子被激活，TSP50基因開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá) TSP50 蛋白，表達(dá) TSP50 蛋白的組織和不表達(dá) TSP50 蛋白的組織進(jìn)行的啟動(dòng)子甲基化水平試驗(yàn)結(jié)果與 TSP50 蛋白在這些組織中的表達(dá)結(jié)果相符，由此證明了 TSP50 啟動(dòng)子 CpG 島甲基化位點(diǎn)的甲基化水平?jīng)Q定了啟動(dòng)子的活性，也決定了 TSP50 蛋白在組織中的表達(dá)。關(guān)于TSP50基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制到目前為止僅有少量研究。堿性成纖維生長因子(bFGF)可以與TSP50啟動(dòng)子中的SP1結(jié)合位點(diǎn),通過 ERK/SPl 通路下調(diào)TSP50表達(dá)[5]。Kosaka-Suzuki等[6]也發(fā)現(xiàn)，TSP50基因上有2個(gè)可以與轉(zhuǎn)錄因子BORIS蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，通過與轉(zhuǎn)錄因子BORIS蛋白結(jié)合可以促進(jìn)TSP50基因的表達(dá)，而結(jié)合位點(diǎn)的突變將導(dǎo)致BORIS無法結(jié)合及喪失其激活啟動(dòng)子的能力。雖然BORIS的表達(dá)很重要，但它對于TSP50的表達(dá)是非常必需的，進(jìn)一步的研究表明BORIS結(jié)合位點(diǎn)與其甲基化狀態(tài)相互獨(dú)立，同時(shí)他們的研究也在生理?xiàng)l件下驗(yàn)證了一種CTA的表達(dá)可以被另一種CTA調(diào)控。Yu等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，TSP50 T310基因突變顯著降低了TSP50誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、集落形成、離體細(xì)胞的侵襲力，最重要的是降低了TSP50在體內(nèi)的致癌作用,可見TSP50蛋白T310基因在TSP50發(fā)揮生物功能中也起重要作用。進(jìn)一步研究表明，其蛋白酶活性中心的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)尤其是第206位表達(dá)的天門冬氨酸，在TSP50介導(dǎo)的細(xì)胞增殖特別是腫瘤的發(fā)生中起的作用大于第310位表達(dá)的蘇氨酸及第153位表達(dá)組氨酸[7]。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默TSP50的表達(dá)后,可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物阿霉素的敏感度,其潛在分子機(jī)制與NF-κB信號途徑相關(guān)[8]。TSP50通過激活細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB信號傳導(dǎo)通路及P53抑癌基因的負(fù)調(diào)控在細(xì)胞的增殖中起重要作用[9-10]。研究TSP50蛋白在腫瘤中的分子機(jī)制，將使關(guān)于TSP50蛋白在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中作用的研究更加明了。

2TSP50表達(dá)與腫瘤

2.1TSP50與乳腺癌乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)國家癌癥中心和原衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示，全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率全國約為42.55/10萬，成為危害女性健康的第一大殺手。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是提高療效、減少病死率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。因此新的腫瘤標(biāo)志物被不斷發(fā)現(xiàn)病應(yīng)用于乳腺癌的早期診斷。TSP50是Shan等[1]在乳腺癌組織中通過MS-RDA分離出來的特殊蛋白質(zhì)，他們應(yīng)用免疫印跡法檢測癌組織的研究表明，大約92%的乳腺癌患者癌組織中有TSP50蛋白表達(dá)，具有很高的陽性率；劉洋等[11]利用免疫組織化學(xué)方法，用單克隆抗體檢測了112例乳腺癌患者組織、乳腺良性腫瘤患者組織及乳腺增生患者組織中TSP50蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，TSP50在乳腺黏液腺癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和乳腺單純癌3種惡性腫瘤組織中陽性率分別達(dá)到100.0%、100.0%和87.5%；而在乳腺纖維腺瘤及乳腺增生中的陽性率僅為14.6%和15.6%，陽性染色出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，而在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞及腫瘤周圍相對正常的組織中表現(xiàn)為陰性；而且早期乳癌患者TSP50蛋白表達(dá)較低。Xu等[2]研究顯示，化合物TI503通過上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-937-5p 和miR-4709-3p的表達(dá)抑制TSP50蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,而土木香內(nèi)酯通過下調(diào)細(xì)胞TSP50的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其具體機(jī)制并不清楚[12]；由此表明，TSP50蛋白在乳腺癌中高表達(dá)，其與乳腺癌密切相關(guān)，可以作為乳腺癌特異性分子標(biāo)記應(yīng)用于乳腺癌的診斷，也可以作為某些抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)，通過阻斷癌組織中TSP50蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖而達(dá)到控制腫瘤的進(jìn)展、改善患者預(yù)后的目的。

2.2TSP50與胃癌胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，雖然在過去的十幾年里，其發(fā)病率下降了約10%，但其發(fā)病率仍排在全球惡性腫瘤發(fā)病率的第4位，且其病死率排在第2位[13]。常用的腫瘤標(biāo)志物如胃癌相關(guān)抗原MG7-Ag(MG7-Ag)、血清胃蛋白酶原Ⅰ(PGI)、PGⅡ等在胃癌的診斷中發(fā)揮了重要作用。而最近的研究表明，TSP50蛋白在胃癌組織同樣高表達(dá)，因此其可能在胃癌的診斷、治療及判斷預(yù)后等方面也有重大意義。茅淑硯等[14]通過研究51例胃癌患者，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測 TSP50蛋白在胃癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TSP50 蛋白表達(dá)陽性45 例，陽性率為 88%。Liu等[15]應(yīng)用組織微陣列技術(shù)對334例胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織蠟塊20例的表達(dá)進(jìn)行檢測的研究表明,TSP50蛋白在191例胃癌患者中呈高表達(dá)，在20例癌旁組織中均呈低表達(dá)；單因素χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，TSP50蛋白表達(dá)在年輕患者、較晚TNM分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例明顯高于年老患者、較早TNM分期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低表達(dá)TSP50病例中位生存年齡為38.02個(gè)月,高表達(dá)TSP50組為30.21個(gè)月；多因素Cox回歸模型顯示，TSP50蛋白表達(dá)是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.017,95%CI=1.078～2.172)。TSP50蛋白在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織及癌旁組織，因此它可作為胃癌新的診斷標(biāo)志物，也可以通過監(jiān)測胃癌患者TSP50蛋白的水平來評估患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及判斷患者預(yù)后，對指導(dǎo)治療、選擇合適治療方案意義重大。但由于研究的標(biāo)本量少，有必要進(jìn)行大標(biāo)本、多中心的臨床驗(yàn)證，以期得到TSP50蛋白在胃癌中的應(yīng)用價(jià)值。

2.3TSP50與結(jié)腸癌關(guān)于TSP50蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況:Zheng等[16]通過RT-PCR與Western blot分析檢測 SW480、SW620、LoVo、HT-29、HCT116、LS174T 和Caco-2 等7 種人結(jié)直腸癌細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)TSP50蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，其表達(dá)水平顯著高于結(jié)直腸腺瘤和正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ROC 曲線評價(jià)其診斷結(jié)直腸癌的特異性、陽性預(yù)測值為92.5%、95.6%;TSP50 高表達(dá)患者的 5 年生存率為 42.8%、中位生存時(shí)間為 48個(gè) 月，而低表達(dá)患者的 5 年生存率為 73.3%、中位生存時(shí)間為 108個(gè)月。多因素Cox回歸模型同樣顯示TSP50蛋白表達(dá)是結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。與此同時(shí)，任雙雙等[17]應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測結(jié)腸癌中 TSP50 蛋白的表達(dá)結(jié)果同樣顯示TSP50蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其陽性率為94%(45/48)。從以上研究可以看出，TSP50蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)有很高的陽性率，并且其水平的高低與腫瘤患者的預(yù)后及生存期有很大聯(lián)系，因此，臨床上可以以檢測腫瘤患者TSP50蛋白水平來篩選高風(fēng)險(xiǎn)患者及評估患者預(yù)后，這對根據(jù)患者情況采取適當(dāng)、有效的個(gè)體化治療具有很大指導(dǎo)意義。

2.4TSP50與喉癌喉癌是一種常見的惡性程度高的鱗狀細(xì)胞癌，雖然其發(fā)病率僅為(1.1～3.4)/10萬人，因其常伴有聲音嘶啞、呼吸困難、咳嗽和吞咽困難等多種并發(fā)癥，這就使喉癌早期診斷很困難，且因此導(dǎo)致其預(yù)后非常差[18]。Zhang等[19]通過應(yīng)用TSP50 shRNA轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞系的HEp2細(xì)胞及敲除HEp2細(xì)胞中的TSP50基因，然后采用Western blot檢測TSP50的表達(dá)水平、MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖、核染色法評價(jià)細(xì)胞的凋亡等，結(jié)果顯示這兩類HEp2細(xì)胞表達(dá)的TSP50顯著下調(diào)、細(xì)胞凋亡增多、且細(xì)胞的增殖和遷移也受到極大的限制。他們研究認(rèn)為這可能與TSP50下調(diào)，抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，此研究讓初步了解了TSP50在喉癌發(fā)生和發(fā)展中的機(jī)制及作用，提示TSP50在喉癌的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用，為喉癌發(fā)生機(jī)制的研究提供一個(gè)新的視角，其也可能成為喉癌治療新的潛在作用靶點(diǎn)。

3問題與展望

TSP50在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、喉癌等多種腫瘤的診斷中具有良好的前景，可是TSP50在腫瘤應(yīng)用的研究過程中仍存在一定的問題：如TSP50蛋白到底在哪些腫瘤中表達(dá)，其在正常組織中的表達(dá)情況如何；由于生物學(xué)功能并不十分清楚，其在癌癥發(fā)生和發(fā)展中所起的作用及機(jī)制到底是怎樣的；TSP50蛋白的表達(dá)與腫瘤的分期有沒有相關(guān)性及相關(guān)性有多大等這些都需要進(jìn)一步研究。目前現(xiàn)有的研究標(biāo)本量較少，結(jié)果具有局限性，有必要擴(kuò)大標(biāo)本進(jìn)行更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證；而且最重要的是腫瘤患者血清中能否也檢測到特異性的TSP50蛋白或抗體，這是作為一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物能否廣泛應(yīng)用于臨床診斷的關(guān)鍵，但現(xiàn)在鮮有文章來驗(yàn)證。隨著研究的進(jìn)展，Wei等[20]采用噬菌體篩選技術(shù)獲得了針對TSP50 片段的特異性單鏈抗體A1基因(scFv-A1)、scFv-A11、scFv-C8，然后把scFv-A1、scFv-A11克隆到pPELB信號肽上并在大腸埃希菌中成功表達(dá)出可溶性蛋白，得到的蛋白通過2次離子交換色譜法和固定化金屬親和層析純化后，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳得到了一個(gè)相對分子質(zhì)量為31×103的蛋白條帶，經(jīng)雙抗體夾心法證實(shí)成功得到TSP50蛋白的單克隆抗體。

TSP50 單克隆抗體制備的成功將使關(guān)于血清中TSP50蛋白或抗體的檢測成為現(xiàn)實(shí)，并且讓通過檢測血清TSP50蛋白或抗體來用于腫瘤診斷成為可能，其同樣讓學(xué)者在研究TSP50蛋白在腫瘤發(fā)病中的機(jī)制、腫瘤的免疫治療和靶向治療等方面的研究取得更大突破。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.030

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1525-03

(收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-02-10)

△通訊作者，E-mail：18237013803@163.com。