膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗法應用于艾滋病病毒抗體初次篩查中的研究價值

謝 芳

（貴陽市疾病預防控制中心檢驗科，貴州 貴陽 550003）

艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種危害性極大的傳染病，由艾滋病病毒（HIV）感染引起，HIV是一種主要攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，其將人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細胞作為攻擊目標，大量破壞免疫細胞，使人體免疫功能低下，導致感染各種疾病，也有引發(fā)惡性腫瘤的風險。HIV抗體檢測是目前診斷AIDS患者感染HIV的重要診斷依據(jù)，以往臨床上主要應用免疫印跡法、膠體層析法、明膠吸附實驗等方法檢測HIV，其中免疫印跡法常作為臨床檢測的金標準，其是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)，具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定與病毒的抗體或抗原檢測等，但該檢測方法試劑成本昂貴，難以進行大范圍的HIV抗體篩查，存在一定局限性[1-2]；膠體層析法應用較多，操作迅速、簡單，適合初次篩查，但有學者指出，該方法檢測的特異度較低，易導致漏檢，對不確定樣本需復檢[3]。酶聯(lián)免疫吸附實驗法是目前臨床實驗室檢測免疫學指標最受歡迎、應用范圍最廣泛的方法之一，被廣泛應用于乙肝、丙肝、梅毒、AIDS及結(jié)核等傳染類疾病的診斷與激素的檢測，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便、成本低、環(huán)保且適合大批量人群篩查等優(yōu)點[4-5]。因此，本研究旨在探討膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗法在HIV抗體初次篩查中的應用，并分析其對HIV感染的診斷價值，為臨床診斷與合理治療AIDS提供指導，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析貴陽市疾病預防控制中心利用全國艾滋病實驗室檢測管理系統(tǒng)收集的2020年9月至2021年9月貴陽市的308例疑似AIDS檢測者的臨床資料。其中男性222例，女性86例；年齡23～54歲，平均（38.28±4.20）歲。納入標準：與HIV攜帶者有性接觸者；所有檢測者均為初次篩選；臨床資料完整者等。排除標準：已接受抗HIV治療者；合并其他血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、肝、腦、心等臟器功能衰竭者；已確診為HIV感染者等。本研究已通過貴陽市疾病預防控制中心醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器 全自動蛋白印跡儀（新加坡健利檢驗診斷有限公司，型號：AutoBlot System-20）；酶標分析儀（深圳市匯松科技公司，型號：MB-580）；全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：PW-960plus）。

1.2.2 檢測方法 采集所有檢測者空腹靜脈血5 mL，離心（3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，時間10 min）后取血清，于-20 ℃環(huán)境中儲存待檢。①膠體層析法：將標本恢復至室溫，取60 μL檢測樣本（微量加樣器），置于試劑卡加樣處，在30 min內(nèi)得到檢測結(jié)果。應用免疫層析原理，對HIV1+2抗體進行定性檢測，血樣中若存在HIV1+2抗體，則硒膠體-?抗原則會結(jié)合HIV1+2抗體。陽性判斷：檢測區(qū)、對照區(qū)均有紫紅色條帶；陰性：僅對照區(qū)可見紫紅色條帶。②酶聯(lián)免疫吸附實驗法：選擇HIV1+2抗原、HIV1+2包被的微孔板，應用過氧化物酶標記，按照說明書完成HIV1+2抗體檢測。取出酶標板，分別設置1孔樣品、1孔空白對照、2孔陰性對照、3孔陽性對照，除空白孔外，每孔分別加100 μL陽性、陰性對照品、樣品。實驗步驟：孵育30 min，反復洗板6次，干燥。除空白孔外，每孔分別加100 μL酶標記抗原，孵育20 min，反復洗板6次，干燥。加底物液，避光反應15 min，隨后加終止液，讀取酶標分析儀上吸光度（OD）值。陽性判斷：樣品OD值≥ 1，否則為陰性。③免疫印跡法[6]：陽性判斷：至少有2條膜帶（gP41/gP120/gP160）或至少1條膜帶與P24帶同時出現(xiàn)；陰性：無HIV抗體特異性條帶出現(xiàn)。

1.3 觀察指標 ①以免疫印跡法為金標準，分析膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗法對HIV感染的檢測結(jié)果、診斷效能。靈敏度 = 真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度 = 真陰性例數(shù)/（假陽性+真陰性）例數(shù)×100%，準確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%，陽性預測值 = 真陽性例數(shù)/（真陽性+假陽性）例數(shù)×100%，陰性預測值 = 真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性） × 100%。②通過酶聯(lián)免疫吸附實驗定量測定陽性樣本帶型分布情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，其中計量資料、計數(shù)資料分別采用(±s)、[例(%)]表示，組間比較分別行t、χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗法與免疫印跡法 HIV感染308例檢測者中免疫印跡法檢測出HIV感染陽性有220例，陰性88例；酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測出HIV感染陽性有219例，陰性89例，陽性檢出率為71.10%（219/308），低于免疫印跡法陽性檢出率的71.43%（220/308），但兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0.008，P＞0.05），見表1。

表1 酶聯(lián)免疫吸附實驗法與免疫印跡法檢測結(jié)果( 例 )

2.2 膠體層析法與免疫印跡法 308例檢測者中膠體層析法檢測出HIV感染陽性有220例，陰性88例，陽性檢出率為71.43%（220/308），與免疫印跡法陽性檢出率71.43%（220/308）比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0.000，P＞0.05），見表 2。

2.3 診斷效能 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測對HIV感染診斷的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值均顯著高于膠體層析法檢測，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 3。

表3 兩種檢測方式的診斷效能比較(%)

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測陽性樣本帶型分布 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測陽性樣本帶型分布情況可見，219例AIDS患者中g(shù)P160、gP120帶型出現(xiàn)率最高，出現(xiàn)率為100.00%，P55出現(xiàn)率最低，出現(xiàn)率為32.88%，見表4。

表4 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測陽性樣本帶型分布情況

3 討論

HIV又被稱為人類免疫缺陷病毒，HIV感染會引起各種機會性感染和腫瘤的發(fā)生，也會引發(fā)群眾的恐慌心理，部分惡性并發(fā)癥會對人的健康生活帶來嚴重影響，甚至會威脅患者生命。近年來，我國AIDS發(fā)病率已經(jīng)進入快速增長階段，做好AIDS預防、控制工作刻不容緩[7]。因此，如何有效防控AIDS已經(jīng)成為臨床上關注的重點。與其他病原微生物檢測相比，HIV檢測的要求更加嚴格，任何微小的錯誤均可能造成檢查結(jié)果誤差，對受檢者造成嚴重影響，因此，保證HIV檢測的靈敏度與特異度非常重要[8]。免疫印跡法作為HIV抗體檢測的金標準，檢測技術(shù)準確率極高，但費用高昂，因此不適合作為廣泛性篩查手段，而在選擇初篩檢測方法時，為降低成本支出，減少檢測人員工作量，應盡量選擇高準確度的HIV抗體初篩方法[9]。

膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗法均是目前常用的HIV抗體初篩方法，其中，膠體層析法可對HIV抗體進行定性，其檢測原理為HIV抗體與硒膠體-?抗原結(jié)合，可被合成肽、重組抗原捕捉固定，顯示紅線，該檢測方法還具有檢測費用低、需要設備少、反應快速等特點，膠體層析法對HIV抗體檢測的檢出率較高，可作為HIV篩查、風險評估的參考依據(jù)，但在應用膠體層析法檢測時，也可能出現(xiàn)漏診、誤診情況[10-11]。

酶聯(lián)免疫吸附實驗法對高、低值質(zhì)控血清的HIV抗體檢出率均處于較高水平，且能夠顯示帶型分布，更適合作為HIV初次篩查手段，從其檢測原理上看，主要是通過將HIV抗原包被于固相載體，然后加入酶標記HIV抗原后，再加入待檢樣品，通過底物顯色，以酶標儀顯示檢測結(jié)果，其利用酶催化底物反應，形成放大效果，有效提高檢測的靈敏度；由于該檢測方法的穩(wěn)定性較高，且受溶血因素影響較小，因此檢測誤差較小[12]。本研究結(jié)果顯示，308例檢測者中免疫印跡法陽性檢出率為71.43%，酶聯(lián)免疫吸附實驗法陽性檢出率為71.10%，膠體層析法陽性檢出率為71.43%；酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值均顯著高于膠體層析法檢測，表明酶聯(lián)免疫吸附實驗法應用于艾滋病病毒抗體初次篩查中的診斷價值更高。酶聯(lián)免疫吸附實驗法可在室溫環(huán)境下完成，無需特殊設備，可一次性檢測多個樣本，操作簡單，更適合廣泛性篩查；此外，通過酶標儀讀取數(shù)據(jù)，降低溫度、標本處理等因素對檢測結(jié)果的影響，也能夠提高酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測結(jié)果的客觀性、準確性及科學性。相關研究顯示，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗法經(jīng)過初次篩選，結(jié)果顯示2 875份標本呈陽性份27份，陽性概率為0.94%，對27份標本進行實驗室確認，其中，確定為陽性份的17份，占原本陽性份62.96%；不確定份4份，占23.53%；陰性份6份，占22.22%，提示酶聯(lián)免疫吸附實驗法運用于艾滋病檢驗中HIV抗體篩查效果較好，但是為了保證準確率，應該規(guī)范操作，同時選取合格標本，保證試劑質(zhì)量，充分降低假陽性率[13]。本研究結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測的219例陽性病例中，gP160、gP120帶型出現(xiàn)率最高，出現(xiàn)率為100.00%，P55出現(xiàn)率最低，出現(xiàn)率為32.88%，說明HIV在gP160、gP120帶型人群中較為活躍、傳染性較強，對此類人群需加強HIV監(jiān)測。

應注意的是，雖然酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測價值高，但也存在假陽性、假陰性情況，可能與實驗操作繁瑣、類風濕因子、人為因素及環(huán)境因素干擾等有關[14]。相關標本干擾因素主要包括以下方面：①內(nèi)源性干擾因素，即高濃度非特異性免疫球蛋白、補體、類風濕因子等。處理方法為，在標本采集后，可用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，在56 ℃溫度下滅活30 min。②外源性干擾因素，即標本采集、送檢、保存過程中因人為或環(huán)境因素引起的污染、溶血、存儲時間過長、加入抗凝物質(zhì)不當、凝集不全等。處理方法為，嚴格按照說明書及無菌操作執(zhí)行相關操作，避免過度劇烈震蕩，防止溶血；待其凝固或血塊收縮后進行離心處理，立即檢測標本。

綜上，與膠體層析法相比，酶聯(lián)免疫吸附實驗法在HIV抗體初次篩查中診斷價值更高，可用于臨床HIV抗體初次篩查。