豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進(jìn)展

馬 花，馬桂蘭，馬 祺，馬忠仁，柏家林，喬自林*

（1.西北民族大學(xué)甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010）

豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進(jìn)展

馬 花1，馬桂蘭2，馬 祺2，馬忠仁1，柏家林1，喬自林1*

（1.西北民族大學(xué)甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010）

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種豬的高致病性和高死亡率的疫病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重?fù)p失，目前尚無特別有效的免疫預(yù)防措施，接種疫苗仍是預(yù)防本病的最重要措施。滅活疫苗安全但保護(hù)力低，弱毒活疫苗有散毒風(fēng)險但是保護(hù)力相對較高，DNA疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和基因缺失疫苗等新型疫苗研究都有較好進(jìn)展。預(yù)防控制和消滅PRRS任重道遠(yuǎn)。

豬繁殖與呼吸綜合征；滅活疫苗；弱毒活疫苗；基因工程疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸道癥狀及死亡的疫病，也稱為豬藍(lán)耳病，是中國的輸入性疫病。1996年郭寶清等[1]從流產(chǎn)死胎中分離出PRRSV證實了中國也有PRRS。從2006年開始，PRRS在我國時常暴發(fā)，每年都會造成大量母豬生殖障礙和仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將PRRS列為B類傳染病，2008年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的新版《一、二、三類動物疫病病種名錄》中已將其列為一類動物疫病[2]。目前，PRRS尚無特別有效的免疫預(yù)防措施，接種疫苗仍是預(yù)防和控制本病的最重要措施之一。

1 PRRSV及特征

PRRSV主要有歐洲型和美洲型兩大類型，兩者核苷酸序列同源性只有60%左右，即使是同一個類型的不同株同源性也不高。在我國流行的主要是北美型PRRSV，屬于以JX-A1和Hu N4等為代表的亞群變異毒株[3-6]。第10次國際病毒大會將PRRSV歸到動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的正單鏈RNA囊膜病毒。RNA基因組本身基因點突變、缺失、插入和替代的突變頻率很高，但在已知的RNA病毒中，PRRSV又是變異率較高的病毒之一。PRRSV在豬肺泡巨噬細(xì)胞、猴腎細(xì)胞MA-104和Marc-145上可增殖培養(yǎng)。PRRSV首先通過肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用而感染易感動物引起病毒血癥，造成母豬生殖障礙和仔豬死亡，對養(yǎng)豬業(yè)存在巨大威脅[7]。

2 PRRS常規(guī)疫苗

目前市場上PRRS常規(guī)疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。

滅活疫苗是將PRRSV在細(xì)胞上大規(guī)模培養(yǎng)后用加熱或化學(xué)劑將病毒滅活后制成的死毒疫苗。Hanada[8]分析了過去十多年P(guān)RRSV的全基因序列后得出PRRSV病毒的進(jìn)化率 (10-2/位/年)要明顯高于其他RNA病毒(10-3～10-5/位/年)，因此，選擇PRRS滅活疫苗生產(chǎn)用的毒株必須具有代表性，應(yīng)與疫病流行地區(qū)分離毒株具有高度同源性。國外已有多種針對美洲型PRRSV株(ISU-P、VD-A11）和歐洲型PRRSV株(LV、VD-E1、VD-E2)的商品化滅活疫苗。國內(nèi)PRRS疫苗研制起步較晚，2000年中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所郭寶清等[9]以我國分離的流行毒株CH-1a為疫苗種毒株，利用Marc-145細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得大量高滴度的PRRSV并研制出油佐劑滅活疫苗，該疫苗抗體達(dá)到高峰后可持續(xù)6個月左右，保護(hù)率可達(dá) 87.3%[10]。2007年山東齊魯保健品有限公司利用SD1株研制出滅活疫苗，并獲得了農(nóng)業(yè)部的臨時生產(chǎn)文號，可用于緊急預(yù)防PRRS。同年，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心利用從疫區(qū)分離的JXA1株制成滅活疫苗，用以緊急預(yù)防PRRS，都為中國當(dāng)時緊急防控PRRS疫情中起了重要作用。經(jīng)過近十年的發(fā)展，國內(nèi)已有十余家獸藥企業(yè)生產(chǎn)PRRS滅活疫苗。滅活疫苗的優(yōu)點在于生產(chǎn)過程中工藝簡單、很少有活病原體污染，運輸與保存方便，動物免疫后不存在感染性病毒的問題。缺點在于免疫效果低，需多次免疫，免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)的時間較短，由于誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平較低，以及各個抗原成分之間的疫苗應(yīng)答不平衡，還可能誘發(fā)其他疾病。

弱毒活疫苗是一種病原致病力減弱但仍具有活力和完整病原的疫苗，也就是用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)后制備的活疫苗。2007年我國以CH-1a病毒株自主研制出了PRRS減毒活疫苗并獲批準(zhǔn)[11]。2010年P(guān)RRS弱毒疫苗接種納入了國家強(qiáng)制免疫計劃，目前批準(zhǔn)的弱毒活疫苗有湖南毒株（HuN4-F112）、江西毒株（JXA1-R）和天津毒株（TJM-F92）[12]。弱毒活疫苗應(yīng)用到生產(chǎn)上最大的爭議在于弱毒株的毒力易返強(qiáng)，對一些極易感動物存在一定的危險性。在德國等歐洲國家禁止用活疫苗來預(yù)防PRRS，主要是采取捕殺的方法凈化豬群；美洲和亞洲國家提倡在未發(fā)生PRRS的豬場中避免使用弱毒活疫苗，而對于已發(fā)生PRRS的豬場免疫時可以采用弱毒活疫苗，但提倡的仍是滅活疫苗。劉海珍等[13]研究表明，首次免疫用弱毒疫苗，加強(qiáng)免疫用滅活疫苗或弱毒疫苗的保護(hù)率能達(dá)到80%以上，比首次免疫和加強(qiáng)免疫均用滅活疫苗的保護(hù)率高出40%以上，說明PRRSV弱毒活疫苗比滅活疫苗更有效。

3 PRRS基因工程疫苗

基因工程疫苗是指使用DNA重組技術(shù)，把天然的或人工合成的遺傳物質(zhì)定向插入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動物細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后制得的疫苗?；蚬こ桃呙绶N類繁多，主要有核酸疫苗、重組疫苗、活載體疫苗和基因缺失苗等。

DNA疫苗是應(yīng)用基因工程技術(shù)把編碼保護(hù)性抗原的基因與能在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體DNA重組，這種目的基因與表達(dá)載體的重組DNA可直接接種到動物體內(nèi)，目的基因可在動物體內(nèi)表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[14]。Pairzadeh B等[15]制備了針對PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗，經(jīng)小鼠和豬體免疫試驗都可檢測到中和抗體的產(chǎn)生。KwangJ等[16]制備了分別表達(dá)PRRSV的ORF4、ORF5、ORF6及ORF7結(jié)構(gòu)蛋白的DNA疫苗并用于動物試驗，結(jié)果86%的豬產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過ELISA、Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)71%的豬產(chǎn)生了與N蛋白相關(guān)的病毒特異性抗體，試驗還證實ORF4和ORF5共表達(dá)的DNA疫苗刺激產(chǎn)生的抗體具有中和活性，表明該DNA疫苗可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的產(chǎn)生。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的PRRSV-BJ24株GP5的DNA重組質(zhì)粒，小鼠免疫和豬體免疫試驗都產(chǎn)生了較高的體液免疫和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生較高水平的淋巴細(xì)胞增殖及NK細(xì)胞殺傷活性，攻毒后可使PRRSV陽性檢出率下降39%。程安春等將克隆的PRRSV SC2株ORF5基因載入pcDNA3.1載體，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5，運用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，并進(jìn)行免疫學(xué)試驗。結(jié)果證明該核酸疫苗可誘導(dǎo)實驗動物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫期時間可持續(xù)長達(dá)135 d以上[17]。隋慧等[18]根據(jù)PRRSV ORF5基因和PCV-2 ORF2基因成功構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-ORF2-ORF5免疫小鼠，結(jié)果顯示實驗小鼠的脾T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量與免疫滅活苗組相比顯著增強(qiáng)，顯示該二聯(lián)疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗尚未得到廣泛的應(yīng)用，人們對它的最大顧慮就是它本身的安全問題，如外源DNA進(jìn)入機(jī)體后是否整合到宿主基因組，導(dǎo)致癌基因激活或抑癌基因失活；疫苗DNA若整合到宿主基因組中表達(dá)后，是否會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，最終會不會導(dǎo)致機(jī)體的免疫力下降；疫苗DNA對機(jī)體而言是一種外來物質(zhì)，是否會引起機(jī)體產(chǎn)生抗DNA抗體等。但是DNA疫苗同其他疫苗相比，DNA疫苗的生產(chǎn)工藝簡單，成分單一，免疫劑量小，安全性相對較高，因此，PRRS的DNA疫苗還是具有潛在的應(yīng)用前景。

亞單位疫苗收集利用病毒表面結(jié)構(gòu)成分制成的不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，是依據(jù)主要保護(hù)性免疫原存在的組分而制成的疫苗，也叫組分疫苗。Prieto C等[19]用大腸桿菌為宿主的PRRSV GP5亞單位疫苗進(jìn)行免疫攻毒試驗，結(jié)果表明免疫組豬群臨床癥狀明顯減輕、中和抗體含量有所提高，但是大腸桿菌中的目的基因表達(dá)后易形成包涵體，目的蛋白得不到修飾加工，限制了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展，最終被桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和酵母真核表達(dá)系統(tǒng)所取代。錢洪喜[20]將構(gòu)建的pPIC9k-ORF7重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞GS115中進(jìn)行蛋白表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物大小約為15 kD，結(jié)果表明N蛋白能與陽性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。也有將基因轉(zhuǎn)入植物中制備出有效的新型亞單位疫苗，Hu Z J等[21]研制的含有PRRSV M蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米口服小鼠，試驗結(jié)果表明小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體和細(xì)胞因子。由于亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白質(zhì)，接種可以避免產(chǎn)生無關(guān)抗原誘發(fā)的抗體，而且具有很好的免疫效果，但是亞單位疫苗存在免疫原性較低的缺點，需與佐劑合用才能產(chǎn)生好的免疫效果。

活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因（目的基因）轉(zhuǎn)移到載體中使之表達(dá)的活疫苗。痘病毒、腺病毒和皰疹病毒等都是用于活載體疫苗制備的理想病毒載體。痘病毒的TK基因可插入大量的外源基因，大約能容納25 kb，而多數(shù)的基因都在2 kb左右，因此可在TK基因中插入多種病原的保護(hù)性抗原基因，制成多價苗或聯(lián)苗，是未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一。CruzJ LG等[22]用豬傳染性胃腸炎病毒為載體表達(dá)野生型PRRSV的GP5和M蛋白，結(jié)果表明接種疫苗的動物比未接種動物產(chǎn)生更快、更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Shen G S等[23]構(gòu)建了能表達(dá)PRRSV ORFSORF3和IL-18-ORF5-ORF3重組雞痘病毒活載體疫苗，對豬初免后21 d加強(qiáng)免疫，初免后60 d進(jìn)行攻毒試驗，結(jié)果表明重組病毒能有效刺激豬外周血中T淋巴細(xì)胞的增殖和干擾素的產(chǎn)生，通過ELISA檢測和病毒中和試驗都可以檢測到針對PRRSV的特異性抗體。Han Y W等[24]研制出能表達(dá)PRRSVORF7的重組減毒沙門菌活載疫苗對豬進(jìn)行免疫試驗，試驗結(jié)果表明豬口服ORF7沙門菌活載體疫苗后產(chǎn)生了ORF7特異性IgG抗體和黏膜IgA抗體；同時減毒沙門菌活載體還可以產(chǎn)生自身的免疫原性?；钶d體疫苗在免疫效果方面可以同時啟動機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，更具吸引力的是可以同時構(gòu)建多價以至多聯(lián)疫苗，達(dá)到一苗防多病的效果。

基因缺失疫苗是用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的疫苗。2012年，武華等[25]報道獲得了一種PRRSV基因缺失疫苗毒株TJM-F92，疫苗接種3 d后豬就產(chǎn)生了抗體，在短期內(nèi)可迅速抵抗藍(lán)耳病自然感染，保護(hù)率達(dá)到80%以上，而且在豬的各生長期和生產(chǎn)期都可以接種該類疫苗?；蛉笔б呙绨踩院谩⒉灰追底?，免疫力較強(qiáng)，免疫期長，尤其適用于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫，其免疫接種與強(qiáng)毒感染相似，機(jī)體可對病毒的多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是較理想的疫苗。盡管該類疫苗目前尚處于試驗研究階段，但為PRRS新型疫苗的研制開辟了新的方向。

4 展望

進(jìn)入21世紀(jì)以來，在我國高度集約化養(yǎng)豬逐步替代了原有分散的小規(guī)模家庭養(yǎng)殖，對疫病防控要求更加嚴(yán)格，特別是高致病性藍(lán)耳病仍在流行，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，防控形勢依然嚴(yán)峻。研制更為高效、安全的疫苗和建立科學(xué)的疫苗接種體系是控制和消滅藍(lán)耳病的重要措施。

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Q813.11

A

1006-799X(2016)19-0060-03

國家民委領(lǐng)軍人才計劃資助，甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項（GNSW-2014-24），西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（31920150029）。

馬 花（1989-），女（回族），寧夏固原人，在讀碩士研究生，主要從事獸用生物制品研究和質(zhì)量控制。

喬自林(1976-)，男，甘肅永靖人，高級實驗師，主要從事動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究。