黃曲霉毒素B1抗體技術研究概況

張寧

（天津市獸藥飼料監(jiān)察所，中國　天津　300402）

專論綜述

黃曲霉毒素B1抗體技術研究概況

張寧

（天津市獸藥飼料監(jiān)察所，中國天津300402）

黃曲霉毒素B1是由曲霉屬黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的具有極強毒性的致癌物，存在于糧食、干果、花生等多種農(nóng)產(chǎn)品及其制品和飼料中。免疫分析法在黃曲霉毒素B1檢測中應用十分廣泛。文中主要介紹了黃曲霉毒素B1免疫分析法的核心——黃曲霉毒素B1抗體的研究概況，以期為黃曲霉毒素B1抗體及相關分析技術的研究提供參考。

黃曲霉毒素B1；半抗原；多克隆抗體；單克隆抗體；單鏈抗體

黃曲霉毒素是20世紀60年代初發(fā)現(xiàn)的一種真菌有毒代謝產(chǎn)物，由曲霉屬黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生。目前，在糧食、油料作物的種子、干果、調(diào)味品、發(fā)酵產(chǎn)品等多種農(nóng)產(chǎn)品及其制品、飼料，甚至在一些酒類中均發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素的存在［1］。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為一類致癌物［2］［3］。黃曲霉毒素最為常用的檢測方法包括：薄層色譜法、高效液相色譜法、質譜法、免疫分析法等。免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和膠體金試紙條等?？贵w是免疫分析方法的核心，高特異性和高敏感性的抗體是免疫分析方法構建的決定因素。在此著重對黃曲霉毒素B1抗體研究進展做一概述。

1　黃曲霉毒素和黃曲霉毒素B1

1.1分離鑒定

目前已分離鑒定的黃曲霉毒素包括AFB1、AFB2，AFB2a，AFG1、AFG2，AFM1、AFM2、AFQ1、AFQ2a等。黃曲霉毒素及其衍生物都具有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮（香豆素）的結構［4］。各種黃曲霉毒素的分子量在312～346之間，熔點為268～269℃，在熔解時，各種黃曲霉毒素也隨之分解。［5］黃曲霉毒素難溶于水、己烷、石油醚，在水中的最大溶解度只有10 μg/L，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二甲基甲酰胺等溶液［6］。結晶的黃曲霉毒素非常穩(wěn)定，高溫（200℃）、紫外線照射均不能使之破壞。在酸性、中性溶液中非常穩(wěn)定，在pH1-3的強酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的堿性溶液中，能迅速分解產(chǎn)生鈉鹽。5%次氯酸鈉可使黃曲霉毒素完全破壞，Cl2、NH3、H2O2、SO2也能破壞黃曲霉毒素。高壓滅菌較難破壞黃曲霉毒素。黃曲霉毒素水溶液對光較敏感，加入30%甘油可使其穩(wěn)定性大為提高［7］。

黃曲霉毒素進入機體組織后，有致癌、致畸、致突變的作用［2］［3］。黃曲霉毒素B1最為常見，是目前所發(fā)現(xiàn)的致癌力最強的物質之一，其次是AFG1、AFG2，其他毒素含量相對微量。黃曲霉毒素進入動物體內(nèi)可生成6種代謝產(chǎn)物，即AFM1、M2、P1、Q1、GM1、GM2，均具有毒性和致癌性，其中AFM1致癌力最強［7］。

由于黃曲霉毒素在自然界的廣泛存在及其對人畜等生物的巨大危害性，世界各國及國際組織紛紛制定了食品中黃曲霉毒素Bl的限量標準。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素含量是國際食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的必檢指標。在我國，依據(jù)《GB 2761—2005食品中真菌毒素限量》，花生、玉米、花生油及其制品的AFB1≤20 μg/kg；大米及其他食用油的AFB1≤10 μg/kg；糧食、豆類、發(fā)酵食品的AFB1≤5 μg/kg；嬰幼兒配方食品中不得檢出。近幾年來，歐盟加強了對黃曲霉毒素的控制，并實施了國際上最為嚴格的黃曲霉毒素限量標準，AFBl≤2 μg/kg，總黃曲霉毒素不得超過4 μg/kg。

1.2抗體

黃曲霉毒素B1抗體是動物機體受到抗原物質刺激后，由B淋巴細胞轉化為漿細胞產(chǎn)生的，能與相應抗原發(fā)生特異性結合反應的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig），稱為抗體（Antibody，Ab）?？贵w是機體對抗原物質產(chǎn)生免疫應答的重要產(chǎn)物，具有各種免疫功能，主要存在于動物的血液（血清）、淋巴液、組織液及其他外分泌液中?？贵w分子由四條多肽鏈，即兩條相同的相對分子質量較小的肽鏈（稱為輕鏈，L鏈）和兩條相同的相對分子質量較大的肽鏈（稱為重鏈，H鏈）組成。輕鏈分為kappa（κ）與lambda（λ）兩型，同一天然免疫球蛋白分子上輕鏈類型總是相同。重鏈根據(jù)其抗原性可分為γ、μ、α、ε和δ鏈五類，由此決定了免疫球蛋白的類型分別為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，同一種動物不同免疫球蛋白的差別由重鏈所決定。重鏈和輕鏈均存在可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)，抗體特異性結合抗原的位置由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構成（VH和VL），即為抗體的抗原結合位點［16］。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，抗體技術也步入分子水平，人工制備抗體已經(jīng)從最初的多克隆抗體、單克隆抗體逐漸發(fā)展到基因工程抗體。抗體作為醫(yī)學生物技術產(chǎn)業(yè)的一個重要支柱，備受研究者的青睞。

1.2抗原

凡是能夠刺激機體產(chǎn)生抗體和效應性淋巴細胞并能與之結合引起特異性免疫反應的物質稱為抗原（Antigen）?？乖肿泳哂锌乖裕庖咴院头磻?。免疫原性是指抗原能夠刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞的特性。反應原性是指抗原與相應的抗體或效應性淋巴細胞發(fā)生特異性結合的特性。因而，根據(jù)抗原物質的抗原性，可以將抗原分為完全抗原和不完全抗原。既具有免疫原性又有反應原性的物質稱為完全抗原（Complete antigen），又稱為免疫原（Immunogen）。大多數(shù)的蛋白質、細菌和病毒等都是完全抗原。而只具有反應原性而缺乏免疫原性的物質稱為半抗原（Hapten），亦稱為不完全抗原（Incomplete antigen）。半抗原多為簡單的小分子物質（分子質量小于1 ku），單獨作用時無免疫原性，但與蛋白質或多聚賴氨酸等大分子載體物質結合后可產(chǎn)生免疫原性。大多數(shù)的多糖、類脂、藥物分子等屬于半抗原［16］。

AFB1相對分子量僅為312.04，屬于小分子半抗原。要制備AFB1特異性抗體，需將AFB1聯(lián)接到大分子載體（如蛋白質）上使之成為完全抗原。與大分子載體物質偶聯(lián)的AFB1可作為免疫原或檢測抗原。常用的載體有牛血清白蛋白（BSA），多聚賴氨酸，人血清白蛋白（HSA）等。

目前，在AFB1抗體研究中，最為常用的載體蛋白是BSA［5］和HSA［10］。偶聯(lián)方法主要采用碳二亞胺法［8］，將AFB1與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應使之生成AFB1的羧甲基肟，然后在水溶性碳化二亞胺（EDPC）的催化下，與載體蛋白質分子中的游離氨基反應，從而偶聯(lián)到蛋白質分子上，成為具有免疫原性的物質［13］。不同研究者對該方法進行了諸多改進，以提高肟的利用率和偶聯(lián)效率，降低AFB1對動物的傷害作用［10］［7］。

也有報道采用與過往研究不同的偶聯(lián)方法［5］?；贛annich-type原理將AFB1直接與陽離子化的BSA相連構建完全抗原。在利用Balb/c小鼠制備多克隆抗體時，該抗原與常規(guī)方法合成的AFB1-oxime-BSA具有相似的敏感性，且能夠更快的激活免疫反應。類似的方法在［15］的研究中也有提及。

1.3AFB1多克隆抗體

將抗原物質經(jīng)不同途徑注入動物體內(nèi)，經(jīng)數(shù)次免疫后采集動物血液，分離出血清，由此獲得針對該抗原的抗血清，即為多克隆抗體（Polyclonal antibody，PcAb）。無論細菌還是病毒抗原，均是由多種抗原成分所組成，即使純蛋白質分子也含有多種抗原表位，由此進入機體后可激活多種淋巴細胞克隆，機體可產(chǎn)生針對各種抗原成分或抗原表位的抗體，由此獲得的抗血清是一種多克隆的混合抗體，具有高度的異質性，所制備的多抗通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質成分。多克隆特性使之作為一種特異性的生物探針或治療制劑仍存在不可避免的缺點。

多克隆抗體在早期AFB1檢測研究中有著一定程度的應用，制備的抗體效價也不盡相同［14］。改進偶聯(lián)方法，提高AFB1肟的利用率和偶聯(lián)效率，制備的兔抗AFB1多克隆抗體效價高達1∶1 024 000［19］。制備了兔抗AFB1多克隆抗體，其中一株滴度亦達到1∶1 000 000，且具有很高的親和力。利用該抗體建立的酶免疫法其檢測線達到了15.8 pg/ ml。由于制備的抗體與黃曲霉毒素類物質具有一定程度的絕對交叉反應性，作者利用其中3株構建了親和層析柱用于黃曲霉毒素的分離純化。

為了在簡化完全抗原制備過程的同時仍保持抗體的高敏感性和特異性，將AFB1與陽離子化的BSA直接偶聯(lián)后制備了鼠抗AFB1多克隆抗體，以該抗體建立的競爭ELISA最低檢測線為1 ng/ml，具有與常規(guī)方法所獲抗體相當?shù)拿舾行浴?/p>

由于多克隆抗體的多克隆特性，目前，商品化的以黃曲霉毒素B1多克隆抗體為基礎構建的檢測試劑盒相對較少。

1.4AFB1單克隆抗體

單克隆抗體（Monoclonal antibody，McAb）是指由一個B細胞分化增殖的子代細胞（漿細胞）產(chǎn)生的針對單一抗原表位的抗體［11］。該類抗體的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨特型的特異性、親和力、生物學性狀及分子結構完全相同。單克隆抗體技術由Kohler和Milstein在1975年建立，通過體外淋巴細胞雜交瘤技術，制備了特異性的單克隆抗體。單克隆抗體技術的問世，極大推動了免疫學及其他生物醫(yī)學科學的發(fā)展。相對于多克隆抗體，單抗具有高特異性、高純度、均質性好、親和力不變、重復性強、效價高、成本低且可大量生產(chǎn)等優(yōu)點［6］。

經(jīng)過30多年的發(fā)展，單克隆抗體已成為應用最為廣泛的抗體技術。在AFB1檢測領域，單克隆抗體業(yè)已逐漸替代多克隆抗體成為研究主流。越來越多的研究者致力于開發(fā)具有更高特異性、敏感性以及更廣譜的AFB1單克隆抗體，以期能夠大大提高檢測靈敏度和檢測效率。［7］利用AFB1-BSA為免疫原制備的幾株針對AFB1單克隆抗體效價均達到1∶1 000 000以上，具有良好的特異性，基于此建立的競爭ELISA檢測限低于0.1 ng/ml［14］。采用AFB1-HSA為免疫原，制備了兩株單克隆抗體。間接競爭抑制ELISA實驗表明，其中一株1B5與B1、B2、G1、G2具有不同水平的交叉反應性，另一株2F1則對上述四種物質具有相當水平的反應特性。在間接競爭抑制試驗中，2F1與固相AFB1-BSA的結合反應，從開始抑制到完全抑制所需的AFB1濃度為0.5～5.0 ng/ml，說明該抗體與AFB1間具有很強的親和力，1B5為0.5～128 ng/ml，表明該抗體與AFB1親和力相對較弱。由此，作者認為1B5相對較弱的親和力易于洗脫更適用于親和層析柱，而2F1則適用于高靈敏度ELISA方法的構建。［11］利用AFB1-BSA作為免疫原建立的單抗腹水效價約1：5 000 000，利用該抗體建立的ELISA方法線性范圍為0.5～50 ng/ml，最低檢測線為0.01 ng/ml。由于單克隆抗體的廣泛應用，類似的研究較為常見［18］。

獲得高效價的抗體滴度是制備抗體的目標之一，對于單克隆抗體來說，融合之前獲得高滴度的血清抗體是免疫良好的表現(xiàn)，也是制備高效價單克隆抗體的關鍵。［2］報道了記憶性淋巴細胞可能有助于免疫動物高效價抗體的形成。作者采用兩種免疫方法得到了差異明顯的兩組免疫效果。正常免疫之后動物繼續(xù)飼養(yǎng)8個月而不進行任何免疫，8個月之后進行加強免疫，2 w后用于單抗制備。此方法所獲免疫動物血清效價達1∶20 000，遠高于正常免疫條件下的1∶500［8］。記憶性淋巴細胞可能是產(chǎn)生該現(xiàn)象的主要因素。但該法由于時間跨度較大，并不適于實驗室或生產(chǎn)條件下的廣泛應用。

在制備高特異性單克隆抗體的同時，更為廣譜的抗體亦受到研究者的青睞［9］。采用小劑量長周期免疫方案制備抗總黃曲霉毒素單克隆抗體。所獲腹水具有相當高的抗體滴度（1∶2.65×107），與B1、B2、G1、G2的交叉反應性分別為100%、57.5%、104%、19%，而與其他霉菌毒素及BSA的交叉反應性均小于0.1%。有望利用該抗體構建高效、廣譜的黃曲霉毒素檢測試劑盒。

基于單克隆抗體構建的商品化試劑盒是目前市場的主力，包括r-Biopharm，Tecna等公司的黃曲霉毒素B1和總黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒及親和層析柱均具有較好的檢測和分離效果。同時，基于單克隆抗體的黃曲霉毒素快速檢測試紙條亦有較為普遍的應用。

2　AFB1單鏈抗體

2.1單鏈抗體（Single-chain antibody，ScFv）

單鏈抗體（Single-chain antibody，ScFv）是利用基因工程原理將天然抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過一條連接肽（Linker，約15-25個氨基酸）連接形成的單鏈分子，使抗體可變區(qū)（Fv片段）穩(wěn)定下來，其分子大小僅為完整抗體的1/6［2］［4］。不僅具有單克隆抗體與抗原特異性結合的特征，更因具有分子量小、組織穿透性好、免疫原性低、易于基因工程操作和構建抗體融合蛋白等諸多優(yōu)點，其在臨床醫(yī)學各領域，尤其在感染性疾病和腫瘤的診斷、治療中日益顯示出其潛在的應用價值［6］。

在黃曲霉毒素檢測領域［19］，從抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體雜交瘤細胞中通過反轉錄PCR擴增出重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，構建了單鏈抗體庫，最終得到3株可以穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素B1的ScFv菌株。誘導表達后可獲得大量高親和力的可溶性ScFv抗體蛋白。作者認為通過該研究，在今后可以將ScFv應用于花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒開發(fā)。在類似的研究中［12］［13］，通過提取免疫了AFB1-BSA的小鼠脾細胞RNA，經(jīng)過RTPCR分別擴增出對應的重鏈和輕鏈可變區(qū)以及連接多肽基因，構建了單鏈抗體庫并獲得了三株可以穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素B1抗體的ScFv菌株。但在該研究中，作者應用基于該菌株表達的單鏈抗體進行的針對花生中黃曲霉毒素B1的檢測實驗并未獲得有說服力的結果［9］［10］［17］。

由于ScFv的表達多采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，因而在重組蛋白轉錄后加工或翻譯后修飾時，特別是當重組蛋白富含二硫鍵時，則很容易形成包涵體造成重組蛋白不能正確折疊。另外，現(xiàn)有的表達系統(tǒng)ScFv表達產(chǎn)量低，未能達到實踐的需求［12］［18］。但是可以肯定的是，隨著基因工程抗體研制技術的發(fā)展和完善，人們可在更大程度上根據(jù)需要改造和制備抗體，ScFv的應用也將更為廣泛。

2.2展望

隨著抗體制備技術以及生物工程技術的不斷發(fā)展，黃曲霉毒素B1抗體歷經(jīng)多克隆抗體、單克隆抗體，到基因工程抗體，抗體技術的不斷發(fā)展也推動了黃曲霉毒素B1檢測研究的快速進步?？偟恼f來，更敏感、特異性更高以及廣譜的檢測方法將是黃曲霉毒素檢測領域的發(fā)展趨勢，由此，與之對應的具有更高特異性、高敏感性以及更廣譜的抗體將是研究者不斷深入研究的目標。

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《網(wǎng)絡食品安全違法行為查處辦法》10月1日起施行

為規(guī)范網(wǎng)絡食品交易行為，保證網(wǎng)絡食品安全，《網(wǎng)絡食品安全違法行為查處辦法》將于2016年10月1日起施行。

《辦法》規(guī)定：網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者建立登記審查等制度、建立入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者檔案、檢查經(jīng)營行為、發(fā)現(xiàn)入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者嚴重違法行為時停止提供平臺服務等義務。

《辦法》明確網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者發(fā)現(xiàn)入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者因涉嫌食品安全犯罪被立案偵查或者提起公訴的，因食品安全犯罪被人民法院判處刑罰的，因食品安全違法行為被公安機關拘留或者給予其他治安管理處罰的，被食品藥品監(jiān)督管理部門依法作出吊銷許可證、責令停產(chǎn)停業(yè)等處罰的應當停止向其提供網(wǎng)絡交易平臺服務。

《辦法》規(guī)定：網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者食品安全違法行為的查處，由平臺提供者所在地縣級以上地方食品藥品監(jiān)督管理部門管轄；對入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者的查處，由入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者所在地或者生產(chǎn)經(jīng)營場所所在地縣級以上地方食品藥品監(jiān)督管理部門管轄。因網(wǎng)絡食品交易引發(fā)食品安全事故或者其他嚴重危害后果的，也可以由網(wǎng)絡食品安全違法行為發(fā)生地或者違法行為結果地的縣級以上地方食品藥品監(jiān)督管理部門管轄。消費者因網(wǎng)絡食品安全違法問題進行投訴舉報的，由網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者所在地、入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者所在地或者生產(chǎn)經(jīng)營場所所在地等縣級以上地方食品藥品監(jiān)督管理部門處理。

網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者和入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者有下列情形之一的，食品藥品監(jiān)督管理部門可以對其法定代表人或者主要負責人進行責任約談：發(fā)生食品安全問題，可能引發(fā)食品安全風險蔓延的；未及時妥善處理投訴舉報的食品安全問題，可能存在食品安全隱患的；未及時采取有效措施排查、消除食品安全隱患，落實食品安全責任等情形。

《辦法》規(guī)定：網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者未履行相關義務，導致發(fā)生嚴重危害后果的，由食品藥品監(jiān)督管理部門依照食品安全法責令平臺停業(yè)，并將相關情況移交通信主管部門處理?！掇k法》還細化了“嚴重后果”情形：致人死亡或者造成嚴重人身傷害的；發(fā)生較大級別以上食品安全事故的；發(fā)生較為嚴重的食源性疾病的；侵犯消費者合法權益，造成嚴重不良社會影響等?！掇k法》還明確網(wǎng)絡食品交易第三方平臺提供者未按要求建立入網(wǎng)食品生產(chǎn)經(jīng)營者審查登記、食品安全自查等制度的或者未公開以上制度的，由縣級以上地方食品藥品監(jiān)督管理部門責令改正，給予警告；拒不改正的，處5 000元以上3萬元以下罰款。

農(nóng)業(yè)部再發(fā)狠招注水肉將無處遁行

農(nóng)業(yè)部日前公布，將組織有關機構修訂豬肉水分含量標注，并對注水肉嚴厲打擊。現(xiàn)行豬肉水分標準太寬松，業(yè)內(nèi)人士稱，即便注了幾十千克的水，按照現(xiàn)行標準檢測，基本上還是合格的，對于打擊注水肉并不給力。已經(jīng)有人大代表就修訂豬肉水分標準提出建議，農(nóng)業(yè)部回應稱，農(nóng)業(yè)部一方面組織中國動物疫病預防控制中心（農(nóng)業(yè)部屠宰技術中心）、中國肉類協(xié)會、中國畜牧獸醫(yī)學會及有關科研院所等單位開展畜禽肉水分限量標準和檢測方法研究，待進一步復核驗證后，《畜禽肉水分限量標準》將提交全國畜禽屠宰加工標準委員會審議；另一方面，組織開展生豬屠宰監(jiān)管“掃雷行動”，嚴厲打擊注水或注入其他物質等各類屠宰違法行為，切實保障豬肉產(chǎn)品質量安全。業(yè)內(nèi)人士介紹，不法商販現(xiàn)在給動物注水，越來越隱蔽，除非當場抓住。市場取樣豬肉，再檢測，檢測結果往往是合格的，修訂肉類水分標準變得很重要。

S816.3

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1004-5090（2016）08-0003-04

2016-06-15）