特異性抗神經(jīng)元抗體對(duì)副瘤性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征及癌癥的預(yù)測(cè)和早期診治價(jià)值

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特異性抗神經(jīng)元抗體對(duì)副瘤性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征及癌癥的預(yù)測(cè)和早期診治價(jià)值

陳齊鳴

副瘤性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征(paraneoplastic neurological syndromes,PNS)是一種與惡性腫瘤密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。它既非癌腫的直接侵犯、壓迫及轉(zhuǎn)移所至，也不是由于癌腫導(dǎo)致的代謝障礙、感染、血管性疾病、惡病質(zhì)及放療和化療的并發(fā)癥引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損害,往往是一種很小的固體腫瘤或處于癌前期階段的腫瘤而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)的遠(yuǎn)隔癥狀。因而PNS可在腫瘤發(fā)生前或與腫瘤同時(shí)也可在腫瘤發(fā)生后或在腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)。與PNS相關(guān)的惡性腫瘤主要見(jiàn)于小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[1-2]、乳腺癌、卵巢癌等婦科腫瘤[3]，還可見(jiàn)于前列腺癌、食管癌、卵巢畸胎瘤、結(jié)腸癌、白血病、胸腺瘤、黑色素瘤、睪丸癌、非何杰金氏淋巴瘤等其它癌腫。近年來(lái)由于發(fā)現(xiàn)了部分PNS患者血清和腦脊液(CSF)中存在特異性抗神經(jīng)元抗體，如抗-Hu抗體(ANNA-1)、抗-Yo抗體(PCA-1)、抗-Ri抗體(ANNA-2)、抗CV2抗體、抗-Amphiphysin抗體及抗-Ma2/TA[3-5]六種確定性抗體，從而認(rèn)為PNS發(fā)病機(jī)制可能與自身免疫有關(guān)，引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界對(duì)此病的強(qiáng)烈關(guān)注，并進(jìn)行了深入而廣泛的研究。

在上述PNS患者自身抗體中，抗-Hu抗體研究較為詳細(xì)。抗-Hu抗體是一種多克隆IgG抗體，主要與中樞及外周神經(jīng)元和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞核中一種相對(duì)分子量為35 000-40 000的蛋白結(jié)合，與細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)輕微，不與核仁反應(yīng)[3-5]。與抗-Hu抗體結(jié)合的蛋白為RNA結(jié)合蛋白的大家族，用抗-Hu抗體篩選人cDNA文庫(kù)可以得到三種不同的目的基因，產(chǎn)生HuD、HuC和Hel-N1三種基因產(chǎn)物，HuD為一種高度保守的人類神經(jīng)元的RNA結(jié)合蛋白，包括3個(gè)RNA結(jié)合位點(diǎn)，在mRNA編碼蛋白質(zhì)中其重要作用，參與神經(jīng)元mRNA前體的剪接、細(xì)胞定位和穩(wěn)定，維持神經(jīng)元的表現(xiàn)型及神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化和發(fā)育[6]。

在SCLC等多種癌腫的癌細(xì)胞中含有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，內(nèi)有HuD蛋白，具有內(nèi)分泌和化學(xué)受體功能，并能誘導(dǎo)針對(duì)HuD蛋白的自身抗體，產(chǎn)生多種PNS。SCLC患者無(wú)論是否發(fā)生PNS，癌細(xì)胞中都有HuD蛋白的高度表達(dá)，并發(fā)PNS的患者，其血清中都有高滴度Hu抗體，且2/3患者Hu抗體出現(xiàn)在SCLC潛伏期中。有抗-Hu抗體的SCLC患者預(yù)后較好，生存期較長(zhǎng)，而且早期發(fā)現(xiàn)的SCLC的患者易得到根治，但有些PNS患者往往是由于神經(jīng)系統(tǒng)早期嚴(yán)重?fù)p傷而致殘。因此，對(duì)SCLC的HuD抗原激發(fā)的PNS進(jìn)行深入研究，特別是探索免疫學(xué)的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于PNS及SCLC的早期診治有重要意義。

1PNS與體液免疫

Vega F[7]等用Schuller數(shù)學(xué)公式對(duì)16例副瘤性腦脊髓炎(PEM)和14例副瘤性亞急性感覺(jué)性神經(jīng)元病(SSN)患者抗-Hu抗體的鞘內(nèi)合成進(jìn)行了計(jì)算并進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)PEM患者CSF中有高滴度抗體88%存在鞘內(nèi)合成，而SSN為7%，兩者相比有極大的差異(P<0.0001),該結(jié)果支持PNS是一種體液免疫密切相關(guān)的自身免疫性疾病。de Graaf等[8]用流式細(xì)胞評(píng)估伴有抗-Hu抗體陽(yáng)性的PNS患者(Hu-PNS)中的主要淋巴細(xì)胞亞群，與對(duì)照組比較，Hu-PNS患者CSF中B細(xì)胞亞群顯示出顯著的絕對(duì)值和相對(duì)值增多，CD4+、CD8+和NK細(xì)胞數(shù)僅顯示絕對(duì)值增多，在Hu-PNS的血與CSF中，相對(duì)的B細(xì)胞增多與抗-Hu抗體的鞘內(nèi)合成結(jié)果一致。

Greealee等[9]認(rèn)為抗-Hu抗體是副瘤性的免疫球蛋白，可識(shí)別所有神經(jīng)元中的細(xì)胞核抗原，發(fā)現(xiàn)IgG抗體能夠進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)并與神經(jīng)元胞內(nèi)蛋白起反應(yīng)，可導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的死亡。用抗Hu血清進(jìn)行大鼠的海馬與小腦腦片培養(yǎng)，即時(shí)評(píng)價(jià)神經(jīng)元抗體的攝取和延遲培養(yǎng)過(guò)程中神經(jīng)元的死亡，為測(cè)試抗-Hu抗體的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)，將靶抗原HuD吸附前與吸附后抗-Hu抗體的IgG血清與大鼠腦片培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)大鼠海馬及小腦神經(jīng)元快速攝取抗-Hu抗體；(2)抗體在活的神經(jīng)元中被攝??；(3)在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的抗-Hu抗體導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；(4)用HuD吸附抗-Hu抗體后顯著減少神經(jīng)元內(nèi)的IgG聚集并且消除了細(xì)胞毒作用。確認(rèn)抗體介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的特異性?？?Hu抗體導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的現(xiàn)象是Hu-PNS患者發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損傷的主要原因。

2PNS與細(xì)胞免疫

實(shí)驗(yàn)室研究表明，通過(guò)激活的CD8+T細(xì)胞加入γ-干擾素共同孵育可以溶解自身注入HuD抗原的纖維母細(xì)胞[10]。

Tanaka[11]認(rèn)為PNS是由惡性腫瘤觸發(fā)的自身免疫過(guò)程，針對(duì)的靶抗原是腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞核共同抗原。攻擊細(xì)胞內(nèi)蛋白的特異性神經(jīng)元抗體可能導(dǎo)致細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。目前有下列發(fā)現(xiàn)支持這一假說(shuō)：(1)腦脊液中單核細(xì)胞突出占優(yōu)勢(shì)；(2)在腫瘤和神經(jīng)組織中有炎性細(xì)胞的侵潤(rùn)，主要是CD8+T淋巴細(xì)胞；(3)在CNS病灶中，利用T細(xì)胞受體檢測(cè)侵潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞是寡克隆的;(4)僅僅抗細(xì)胞內(nèi)蛋白抗體如抗-Hu抗體并不能產(chǎn)生疾病模型;(5)Hu-PNS周圍血中的單個(gè)核白細(xì)胞(PBMC)分離CD8+T細(xì)胞中可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有活性的CTL;(6)Hu-PNS具有共同人類白細(xì)胞Ⅰ型抗原(HLA)決定簇，表明Hu-PNS在細(xì)胞表面提交某些抗原多肽可刺激CD8+T細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞攻擊靶組織?？乖禺愋缘腃 TL介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是將來(lái)建立腫瘤免疫和PNS神經(jīng)疾病動(dòng)物模型潛在的研究方向。

De Jongste[12]利用多參數(shù)流式細(xì)胞儀對(duì)11例新診斷為Hu-PNS患者血清與CSF配對(duì)標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞亞群及樹狀突細(xì)胞進(jìn)行了研究，與9例其它炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，12例其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行對(duì)照，患者CSF中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、中央記憶T細(xì)胞、類別轉(zhuǎn)換性B細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞升高。這些研究結(jié)果支持Hu-PNS局部激活免疫系統(tǒng)，提示Hu-PNS和其它炎癥性CNS疾病有共同的致病途徑。

3尚未解決的科學(xué)問(wèn)題和國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀

上述研究雖然有所見(jiàn)解和收獲，但是確缺乏深入系統(tǒng)和廣泛的研究，很多的現(xiàn)象無(wú)法用現(xiàn)有的理論去解釋。目前發(fā)現(xiàn)相同的腫瘤HuD抗原導(dǎo)致的PNS的表現(xiàn)型差異性較大，如：(1)70%的惡性腫瘤患者在確診前就出現(xiàn)PNS[13]。(2)抗-Hu抗體與SCLC和PNS三者的組合中有多種表現(xiàn)型，PNS可累及CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)各個(gè)不同部位神經(jīng)元造成損害,如亞急性感覺(jué)性神經(jīng)元病是以周圍神經(jīng)損害為主，而邊緣葉腦炎是以大腦顳葉海馬的神經(jīng)元損傷為主[13-15]；(3)SCLC伴抗-Hu抗體的患者,腫瘤生長(zhǎng)隱匿,腫塊通常很小,生存期較一般腫瘤患者延長(zhǎng)，而且可以緩解，預(yù)后較好，提示HuD抗原激發(fā)的免疫效應(yīng)不僅僅損傷CNS，也有顯著的抑瘤效應(yīng)[3，16-17]；(4)不同的腫瘤如十二指腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肺腺癌、乳腺癌等可產(chǎn)生相同的抗-Hu抗體和不同的PNS[18-19]。上述種種謎團(tuán)尚未得到解決。

我們?cè)谠瓏?guó)家教育部、安徽省人事廳、科技廳、教育廳、衛(wèi)生廳以及法國(guó)巴黎居里大學(xué)Salpêtrière醫(yī)學(xué)院附院Dlattre教授及法國(guó)醫(yī)科院神經(jīng)分子免疫實(shí)驗(yàn)室(INSERMU 134)Schuller教授的大力支持下于1993年開展了對(duì)PNS的臨床及免疫學(xué)研究，在國(guó)內(nèi)報(bào)道3種特異性神經(jīng)元抗體與PNS的臨床表現(xiàn)、臨床分型及相關(guān)腫瘤之間的關(guān)系，建立了實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，開展了對(duì)抗-Hu、抗-Yo及抗-Amphiphysin抗體的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PNS/SCLC患者血清中抗-Hu抗體滴度高達(dá)1：64 000,CSF中高達(dá)1：4 000，尿液中高達(dá)1：200，在患者CNS中存在特異性抗體合成，抗體特異活性明顯增高[19]。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)10例PNS患者外周血T細(xì)胞亞群、活化及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并與正常人及SCLC患者比較，發(fā)現(xiàn)PNS患者外周血CD3+，CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+降低，活化T細(xì)胞增多及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少。提示其細(xì)胞免疫功能總體處于低下狀態(tài)；并有T細(xì)胞過(guò)度激活及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫抑制功能的降低[20]。針對(duì)PNS患者外周血單個(gè)核白細(xì)胞(PBMC)的增殖反應(yīng)及其對(duì)SCLC細(xì)胞株(H446)的抑制作用發(fā)現(xiàn)PNS患者的PBMC經(jīng)白介素-2刺激后，患者CD4+比例(76.54±3.96)%較正常對(duì)照組(51.75±7.3)%顯著升高(P<0.05),所以PNS患者PBMC增殖反應(yīng)以CD4+T細(xì)胞為主[21]。國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果均表明PNS與自身腫瘤抗原導(dǎo)致的自身免疫有關(guān)。

4科學(xué)假設(shè)

HuD抗原在PNS自身免疫致病過(guò)程中可能起激發(fā)作用，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生體液免疫出現(xiàn)高滴度的特異性神經(jīng)元自身抗體，產(chǎn)生體液免疫作用于中樞神經(jīng)元，另一方面也激發(fā)宿主CNS中的特異性細(xì)胞免疫，涉及到某些T細(xì)胞亞群如CD4+，CD8+，Th17/Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及NKT細(xì)胞。宿主體內(nèi)發(fā)生的自身免疫反應(yīng)對(duì)患者一方面有保護(hù)作用，抑制和殺傷自身腫瘤細(xì)胞，使高度惡性SCLC很少轉(zhuǎn)移。另一方面卻把自身中樞神經(jīng)元誤認(rèn)為腫瘤細(xì)胞，造成自身神經(jīng)元損傷，而導(dǎo)致多種CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)副瘤綜合征。針對(duì)上述現(xiàn)象,我們對(duì)于HuD激發(fā)的PNS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提出以下幾種假設(shè):(1)抗-Hu抗體是多克隆免疫球蛋白IgG，識(shí)別神經(jīng)元中的胞核抗原，抗體能夠主動(dòng)進(jìn)入CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元內(nèi)并與神經(jīng)元胞內(nèi)蛋白HuD起反應(yīng)，直接導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的死亡;(2)特異性神經(jīng)元抗體和CTL共同作用于CNS的不同部位神經(jīng)元死亡而導(dǎo)致PNS異質(zhì)性;(3)PNS患者個(gè)體免疫應(yīng)答機(jī)制不同，存在明顯的輔助性T細(xì)胞亞群(Th1/Th2,Th17/Treg)之間平衡失調(diào)，而產(chǎn)生自身免疫的病理過(guò)程。

為闡明PNS發(fā)病機(jī)制及早期診治PNS及相關(guān)的惡性腫瘤找到新的突破口，本課題擬采用如下方法和技術(shù)：(1)制備神經(jīng)元核蛋白HuD基因產(chǎn)物為激發(fā)抗原，刺激伴有SCLC的Hu-PNS患者體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞亞群并進(jìn)行分析；(2)分析HuD抗原刺激前后的Th1/Th2，Th17/Treg失衡；(3)采用活細(xì)胞熒光染料CFSE標(biāo)記法測(cè)定淋巴細(xì)胞針對(duì)照射后SCLC細(xì)胞的增殖反應(yīng)；(4)采用碘化丙酊和CFSE雙標(biāo)記法測(cè)定HuD特異性效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)SCLC細(xì)胞的毒性作用；(5)應(yīng)用ELISPOT技術(shù)，測(cè)定特異性T細(xì)胞克??；(6)建立人SCLC種植裸鼠動(dòng)物模型，觀察抗-Hu抗體和/或HuD特異性T細(xì)胞在活體內(nèi)對(duì)宿主CNS的破壞作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

5科學(xué)意義

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該項(xiàng)目基礎(chǔ)理論研究比較薄弱，因而積極深入探討PNS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，以達(dá)到早期診斷PNS、阻斷自身免疫系統(tǒng)對(duì)宿主CNS損傷、提高抗腫瘤免疫的作用，期望最終達(dá)到預(yù)防或者治愈這種致殘率死亡率較高的疾病并發(fā)掘全新的抗腫瘤的治療方法。

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[作者單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,安徽 蚌埠 233004

·述評(píng)·

收稿日期：(2015-11-26)

DOI：10.14126/j.cnki.1008-7044.2016.01.001

[作者簡(jiǎn)介]陳齊鳴(1956-)，男，教授/主任醫(yī)師，研究生。