卵巢冷凍移植的發(fā)展歷程及研究現(xiàn)狀

范東青，張璨，胡艷秋

卵巢冷凍移植的發(fā)展歷程及研究現(xiàn)狀

范東青，張璨，胡艷秋△

女性生育力保存的方式包括胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢冷凍移植。胚胎冷凍技術(shù)相當(dāng)成熟，玻璃化冷凍胚胎存活率已達90%以上，卵子冷凍也取得了一定進展，相較于前兩種保存生育力的方法，卵巢冷凍移植不僅能夠保存生殖功能，也有望保存內(nèi)分泌功能。目前人類卵巢移植主要包括新鮮或冷凍卵巢組織的原位或異位移植。卵巢移植的影響因素包括冷凍保存過程、移植部位及移植前預(yù)處理等。隨著器官冷凍技術(shù)及顯微外科技術(shù)的完善，整體卵巢冷凍移植逐漸成為卵巢保存的發(fā)展方向。但整體卵巢移植尚處于動物實驗階段，人整體卵巢冷凍保存處于探索階段，尚無統(tǒng)一的冷凍及解凍程序。綜述了卵巢冷凍保存及移植的發(fā)展歷程及研究現(xiàn)狀。

卵巢；低溫保存；冷凍；移植，自體

【Abstract】Themethods of female fertility preservation includes embryo cryopreservation，occyte freezing and ovarian tissue cryopreservation.The embryo freezing technology has been well developed with the survival rate over 90%.The oocyte freezing technology has also yielded progress in recent years.The ovarian tissue cryopreservation and transplantation has a predominance in the preservation of both endocrine function and reproductive function.Currently，human ovarian transplantation mainly consists of the orthotopic and heterotopic transplantation of fresh or cryopreserved ovarian tissue.The factors related to ovarian transplantation include the process of cryopreservation，transplantation site and pretreatment before transplantation，etc.With the increasingly improved technology of organ freezing and microsurgery，cryopreservation and transplantation of whole ovary have been the trend of ovarian preservation.However，the whole ovary transplantation is still at the stage of animal experiments.There are not the standard procedure of cryopreservation and thawing.The research progress of ovarian cryopreservation and transplantation was reviewed.

【Keyw ords】Ovary；Cryopreservation；Freezing；Transplantation，autologous

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：405-408）

近年來關(guān)于女性生育力的保存?zhèn)涫荜P(guān)注，有研究指出，女性生育力特別是35歲以上的女性生育力隨著年齡遞增而降低。玻璃化冷凍胚胎為許多生育力降低的女性帶來了福音［1］。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，癌癥患者5年生存率升高［2-3］，尤其小于40歲的女性癌癥患者比例逐漸升高［4］，但治療癌癥的方法諸如放化療對女性的卵巢功能也產(chǎn)生了不同程度的損傷，如何保存此類女性的卵巢功能成為很多學(xué)者關(guān)注的熱點。卵巢保存移植不受女性年齡、有無配偶、道德倫理等限制，也為子宮內(nèi)膜異位癥患者及急性良性婦科疾?。?］（如卵巢蒂扭轉(zhuǎn)）患者提供了保存生育力的方案。

20世紀90年代，隨著冷凍科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和改進以及各種抗凍劑的出現(xiàn)，卵巢組織冷凍發(fā)展非常迅速，不斷有小鼠、兔子、綿羊和非人類哺乳類動物卵巢組織冷凍實驗研究報道，并有凍融卵巢組織移植成功的案例。關(guān)于人類卵巢組織保存及移植的試驗也正進行中，研究表明，人的卵巢組織能夠耐受低溫冷凍，卵巢皮質(zhì)組織在凍融前后外觀及卵泡發(fā)展階段并沒有區(qū)別，卵泡閉鎖比例也未見明顯不同［6-7］。2004年Donnez等［8］報道了采用程序化冷凍方法保存卵巢組織，解凍后自體原位移植，術(shù)后半年就恢復(fù)了月經(jīng)周期，并有周期性排卵及黃體生成，最終患者獲得了成功妊娠并順利分娩，這說明了人類卵巢移植的可行性。

1　卵巢移植的主要類型、特點

1.1根據(jù)供受體關(guān)系

1.1.1自體移植不受到免疫排斥反應(yīng)的影響，手術(shù)后的并發(fā)癥相對少，自體移植能恢復(fù)女性的正常月經(jīng)，維持女性正常激素水平，迄今為止自體移植已經(jīng)取得了很大發(fā)展。通過卵巢移植，一般卵巢功能可維持12個月，有些甚至持續(xù)了4～5年［9-10］。①自體異位移植：主要是帶血管蒂的卵巢組織移植和無血管的卵巢組織切片移植。自體異位移植在臨床實踐中現(xiàn)已經(jīng)被應(yīng)用，并且術(shù)后預(yù)后很好［10］。②自體原位移植：自體原位移植最大的優(yōu)點是可以基本保存自然的組織結(jié)構(gòu)和生殖功能。人類原位移植的研究主要是將卵巢移植到卵巢皮質(zhì)下和卵巢所在部位腹膜下。2015年1例28歲葡萄牙女性接受冷凍10年卵巢組織進行自體原位移植，術(shù)后通過卵巢刺激方案獲得2個卵子，并成功獲得1枚胚胎［11］。

1.1.2同種異體移植其面臨的最大難題就是免疫排斥反應(yīng)，其次是供體提供者的問題。在人卵巢組織的異體移植中，因供體卵巢組織的來源受到限制，以及目前抗排斥的免疫藥物的毒性、不良反應(yīng)等諸多因素，使得卵巢組織的異體移植在臨床實踐中受到限制。國外學(xué)者將研究方向?qū)Ｗ⒂谕央p胞胎姐妹間及具有血緣關(guān)系的親屬之間的卵巢移植，2009年Silber［12］對10對一方患有卵巢功能早衰的雙胞胎進行了新鮮卵巢組織移植及整體卵巢移植，結(jié)果有10次自然妊娠，最終7例健康嬰兒出生，其中帶血管蒂吻合的整體卵巢移植的患者，術(shù)后卵泡刺激素（FSH）及黃體生成激素（LH）水平在所有卵巢移植患者中最低，在移植后2年成功妊娠并分娩一嬰兒。1.1.3異種移植有更強烈、迅猛的免疫排斥反應(yīng)。有研究將人類凍融卵巢組織移植到免疫缺陷小鼠，移植后小鼠出現(xiàn)了一系列生理過程，包括原始卵泡、竇卵泡正常的形態(tài)、黃體生成及MⅡ期卵母細胞的出現(xiàn)［13-16］。異種移植現(xiàn)僅處于實驗研究階段，帶有免疫缺陷基因的嚙齒類動物（如鼠類）是人類卵巢組織皮質(zhì)異種移植材料。

1.2根據(jù)卵巢是否完整

1.2.1卵巢皮質(zhì)組織移植Oktay等［9］、Bagis等［17］研究表明，卵巢皮質(zhì)組織移植新血管形成期間的局部缺血可持續(xù)3～7 d，在此期間50%或更多的原始卵泡和幾乎所有生長中卵泡都會消失。這縮短了移植后的卵巢組織具有功能的時間，因而限制了凍融卵巢組織片段的臨床應(yīng)用。

1.2.2整體卵巢移植2006年Imhof等［18］通過微血管吻合術(shù)對凍融后綿羊整體卵巢行原位自體移植，其中1只綿羊在移植術(shù)后1年獲得自然妊娠并活產(chǎn)1只健康小羊。2009年Silber［12］的研究中，接受整體卵巢移植的女性在移植后成功妊娠，并足月分娩。2014年Campbell等［19］研究表明，采用低溫冷藏及移植術(shù)后優(yōu)化抗凝機制技術(shù)，整個卵巢冷凍后再自體移植的成年綿羊全部恢復(fù)了卵巢功能，其自然妊娠率64%，活產(chǎn)率29%。冷凍保護劑灌注時間及灌注速率對卵巢功能恢復(fù)起關(guān)鍵作用。可以認為，帶有血管蒂整體卵巢移植將成為未來的研究方向。

2　卵巢移植的影響因素

2.1冷凍保存過程卵巢組織的冷凍效果，與冷凍保護劑類型和濃度、卵巢組織大小、冷凍速度及脫水時間等有關(guān)。對于整體卵巢冷凍而言，還與冷凍保護液灌注速率、灌注時間有關(guān)。

2.1.1滲透性冷凍劑二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）和甘油（GLY），通過滲透細胞起到保護作用；Milenkovic等［20］用2種程序化冷凍方案［1.5mol/LDMSO和1.5mol/L林格醋酸鹽（RA）］對羊整體卵巢的冷凍效果進行了比較，DMSO作為冷凍保護劑效果優(yōu)于RA。

2.1.2卵巢組織塊形態(tài)大小大多處理為厚約1 mm，表面積1mm2～1 cm2。Scott等［21］冷凍不同形狀的人類卵巢組織，解凍后進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，立方體形的組織塊第7天就出現(xiàn)較多的存活卵泡且卵泡生長較好，較其他形狀的組織塊更有優(yōu)勢。

2.1.3冷凍方式①慢速程序化冷凍：需要昂貴的程序化冷凍儀，耗時，可能破壞了卵巢組織蛋白的完整性，優(yōu)點是可批量處理組織，技術(shù)相對成熟且已取得了顯著成果。②玻璃化冷凍：簡便、快捷、經(jīng)濟，避免了胞漿內(nèi)冰晶形成，在保護顆粒細胞、膠原束、細胞間隙和始基卵泡等方面具有優(yōu)勢，但樣本量較大時操作繁復(fù)、勞累。玻璃化冷凍還處于研究階段，其安全性和有效性尚待進一步證實。

2.1.4冷凍載體體積小、傳熱快且安全的冷凍載體可提高冷凍效果。目前常用于冷凍卵巢組織的載體有2mL冷凍管、0.25mL標準麥管、銅網(wǎng)和Cryotop法等。Cryotop法使標本直接與液氮接觸，較易發(fā)生生物污染；2mL冷凍管降溫速度最慢，多用于慢速程序化冷凍。

2.1.5整體卵巢冷凍保護劑的灌注速率及灌注時間

Isachenko等［22］測定了牛整體卵巢的不同灌注速率對冷凍效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以0.83m L/min、0.42 mL/min灌注60min效果最好。

2.2移植部位

2.2.1異位移植肌肉內(nèi)移植、腎被膜下移植及皮下移植三者比較，皮下移植的血管周圍細胞和卵泡完整性受損情況最重，腎被膜下移植次之；移植物回收率和卵泡存活率也逐漸降低。

2.2.2原位移植部位靠近輸卵管，若移植效果良好，可能自然受孕。2011年Janse等［23］對接受化療的癌癥患者進行了卵巢皮質(zhì)組織原位移植，最終患者成功妊娠并順利分娩一嬰兒。

2.3移植前預(yù)處理

2.3.1抗氧化作用氧化作用會對細胞膜、內(nèi)皮細胞膜、線粒體膜造成損害。減少缺血-再灌注過程中的過量活性氧生成，可以防止移植物功能恢復(fù)延遲和功能早衰，抗氧化劑如抗壞血酸、甘露醇、氧四環(huán)素、褪黑素、維生素C、維生素E，能減輕一定的血管內(nèi)皮損傷。

2.3.2加快促使新血管形成①生長因子因素能誘導(dǎo)血管形成，如纖維母細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。局部應(yīng)用VEGF較系統(tǒng)使用VEGF可能更有效。②氨醇磷酸酯能促進卵巢移植物中血管的生成，能減輕組織的缺血再灌注損傷［24］。③移植前催生肉芽組織可以減少缺血損傷。卵巢移植炎癥反應(yīng)可以促進血管再生。

2.3.3激素在卵巢組織移植過程中，促性腺激素（Gn）的處理時間和處理部位對卵泡的存活具有重要調(diào)節(jié)作用。Imthurn等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在移植前后2 d注射Gn，可使移植組織中的卵泡數(shù)量明顯增多，其作用機制可能是通過上調(diào)血管生成因子來發(fā)揮作用。Maltaris等［26］認為移植后短時間給予外源性Gn可促進血管再生，而長時間給予會導(dǎo)致始基卵泡消耗增加。目前，移植前后應(yīng)用Gn尚無統(tǒng)一結(jié)論。

3　目前遇到的問題及其發(fā)展前景

卵泡數(shù)量是最直接反映卵巢儲備功能的一個指標。減少冷凍復(fù)蘇過程中卵泡的損傷在卵巢組織移植中尤為重要。缺血性損傷對原始卵泡生長及卵巢基質(zhì)都有影響。早期一些關(guān)于無血管卵巢移植的研究中表明在新血管形成之前，有大量卵泡丟失。新血管形成的機制尚不明確。鑒于無血管卵巢組織移植血管重新生成時間較長，造成的缺血損傷大，近年有研究提出帶血管蒂整體卵巢移植，在血管重建后迅速恢復(fù)血流，以有助于減輕缺血性的損傷，理論上帶血管蒂的整體卵巢移植可通過直接對血管進行吻合而減少組織的缺血損傷，有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以長久維持。然而目前整體卵巢移植結(jié)果是卵泡密度顯著降低，不管是冷凍還是未冷凍卵巢。原因在于卵巢含有各級卵泡和基質(zhì)細胞，對冷凍保存條件要求不同，整個器官的保存缺乏標準方案，冷凍保護液沒有完全浸透組織、血管重建技術(shù)有待提升。要獲得整體卵巢冷凍移植的成功，需進一步解決上述問題。盡管尚未見整個卵巢冷凍移植的報道，但正在嘗試的同卵雙胞胎之間使用整體卵巢移植，能夠恢復(fù)卵巢的功能［27］。還有學(xué)者提出卵巢組織移植合并卵泡體外培養(yǎng)來保存生育力，但這需要完善物種特異性培養(yǎng)體系、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)液添加物/補充物的使用、氧氣的最適濃度、培養(yǎng)后卵泡質(zhì)量的評估等［28-29］。

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Ovary Cryopreservation and T ransp lantation

FAN Dong-qing，ZHANG Can，HU Yan-qiu.
Dalian Medical University，Dalian 116044，China（FAN Dong-qing，ZHANG Can）；Reproductive Center，Subei People's Hospital，Yangzhou 225001，Jiangsu Province，China（HU Yan-qiu）
Corresponding author:HU Yan-qiu，E-mail:yanqiuhu@yahoo.com

2016-05-13）

［本文編輯王昕］

116044大連醫(yī)科大學(xué)（范東青，張璨）；蘇北人民醫(yī)院生殖中心（胡艷秋）

胡艷秋，E-mail：yanqiuhu@yahoo.com

△審校者