煙曲霉熒光探針實(shí)時(shí)PCR法的臨床應(yīng)用價(jià)值研究*

邢志芳,曹國君，趙 縝，趙紅英，潘惠芬，夏建紅

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院輸血科,上海 201199；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,上海 200040；3.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 201199；4.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261053)

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·論 著·

煙曲霉熒光探針實(shí)時(shí)PCR法的臨床應(yīng)用價(jià)值研究*

邢志芳1,曹國君2△，趙 縝3，趙紅英4，潘惠芬3，夏建紅3

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院輸血科,上海 201199；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,上海 200040；3.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 201199；4.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261053)

目的 建立一種針對(duì)煙曲霉的探針實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法并初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 以煙曲霉基因組內(nèi)特有序列為靶位，設(shè)計(jì)引物、探針，建立PCR反應(yīng)體系，初步應(yīng)用于臨床痰標(biāo)本和血漿標(biāo)本的檢測(cè)驗(yàn)證其檢測(cè)性能。結(jié)果 所建針對(duì)煙曲霉的實(shí)時(shí)PCR法具有良好的靈敏度和特異度，將其應(yīng)用于臨床痰標(biāo)本和血漿標(biāo)本的檢測(cè)效果較好。結(jié)論 所建立的熒光探針實(shí)時(shí)PCR法初步應(yīng)用于臨床痰標(biāo)本和血漿標(biāo)本檢測(cè)，效果良好，其實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。

煙曲霉菌； 探針實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法； 臨床應(yīng)用

近年來，侵襲性真菌病(IFD)的致死率仍居高不下，IFD的早發(fā)現(xiàn)、早治療仍是當(dāng)前改善患者預(yù)后的最佳途徑。而由于IFD缺乏特異性的臨床癥狀和體征，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法在靈敏度和特異度等方面存在缺陷，導(dǎo)致IFD的臨床診斷率和實(shí)驗(yàn)室診斷率偏低[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，使人們將IFD的早檢測(cè)、早發(fā)現(xiàn)寄希望于分子生物學(xué)手段，雖然此方法尚不成熟，但具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[2-3]。本課題組在前期工作中建立了SYBR染料法實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)體系，但由于此方法的原理是利用熒光染料結(jié)合到DNA上發(fā)光而實(shí)現(xiàn)定量，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)發(fā)生非特異性擴(kuò)增時(shí)難以辨別，即與探針法實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系相比，此方法在特異性方面存在缺陷，制約了將來其在臨床的推廣應(yīng)用。為此，本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了探針法實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系，并將其應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)，取得了良好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取前期實(shí)驗(yàn)中的160例免疫低下患者的194例痰標(biāo)本作為研究對(duì)象[4]，同時(shí)選取瑞金醫(yī)院40例已明確臨床IFD診斷的骨髓移植患者的112例血漿標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 材料、儀器與試劑 同前期實(shí)驗(yàn)[5]。

1.3 真菌基因組DNA提取 具體方法同前期實(shí)驗(yàn)[6]。

1.3.1 煙曲霉實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法(探針法)的建立 在前期實(shí)驗(yàn)所建立的SYBBR染料法實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系的基礎(chǔ)之上[5]，原引物和反應(yīng)體系不變，設(shè)計(jì)合成新探針，具體序列為5′FAM-GCA AGG CGA TTT ATC TCA CCA CT-3′TARMA，PCR擴(kuò)增條件為：50 ℃，2 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。構(gòu)建含靶片段的PMD19-T質(zhì)粒重組體，制備梯度濃度的標(biāo)本，驗(yàn)證該方法的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)驗(yàn)證其特異性，具體操作同前。

1.3.2 煙曲霉實(shí)時(shí)PCR用于臨床標(biāo)本的檢測(cè) 以所建立的煙曲霉實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)194例來自臨床的痰標(biāo)本和112例血漿標(biāo)本DNA,并初步驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值，并將其結(jié)果與之前通用PCR法結(jié)果(擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析)進(jìn)行比較，同時(shí)將煙曲霉探針法實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)陽性的標(biāo)本送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證；為排除由抑制物引起的假陰性情況，對(duì)所有的標(biāo)本均進(jìn)行人GAPDH基因檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉實(shí)時(shí)PCR法的檢測(cè)性能 PCR擴(kuò)增曲線良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.293 921，截距為46.210 117，相關(guān)系數(shù)為0.994 966，提示相關(guān)性良好，可以滿足實(shí)驗(yàn)的基本要求；線性檢測(cè)范圍的上限為108copy/mL,下限為102copy/mL，提示檢測(cè)靈敏度較高；以非煙曲霉基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，未見非特異性擴(kuò)增，表明該擴(kuò)增體系的特異性較好。

2.2 煙曲霉實(shí)時(shí)PCR法的臨床應(yīng)用效果 在194例臨床痰標(biāo)本DNA中包含176例念珠菌陽性標(biāo)本，2例煙曲霉陽性標(biāo)本，16例陰性標(biāo)本，經(jīng)該煙曲霉探針法實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，2例陽性標(biāo)本均被檢出，其他192例標(biāo)本均未出現(xiàn)擴(kuò)增，該結(jié)果與原實(shí)驗(yàn)通用PCR法結(jié)果一致，符合預(yù)期，且提示此實(shí)驗(yàn)中該方法的檢測(cè)靈敏度和特異度均為100%；骨髓移植患者的112例臨床標(biāo)本中，包含2例煙曲霉菌，用所建立的煙曲霉探針法實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，均可以檢出，而其他110例標(biāo)本則未出現(xiàn)擴(kuò)增，同樣說明所建立的新方法具有良好的檢測(cè)性能。將煙曲霉陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序分析結(jié)果與PCR結(jié)果一致。以上兩類標(biāo)本，均對(duì)其進(jìn)行了人GAPDH基因檢測(cè)，擴(kuò)增曲線良好，均提示標(biāo)本中無明顯的擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑存在。

3 討 論

真菌多為條件致病菌，對(duì)免疫力正常的人群一般不會(huì)致病，然而當(dāng)機(jī)體處于免疫妥協(xié)狀態(tài)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致IFD的發(fā)生[7]。以往的臨床研究大多僅重點(diǎn)關(guān)注移植患者的IFD情況，而非移植群體的情況相關(guān)報(bào)道少見[8]。近年來，IFD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且其致病菌種的流行病學(xué)也在不斷變化[9]。由于IFD無特異性的臨床癥狀和體征，且容易被基礎(chǔ)疾病或免疫抑制所掩蓋，因此其確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室真菌檢測(cè)方法因在靈敏度和特異度等方面存在缺陷，IFD的實(shí)驗(yàn)室檢查漏診率高，不能滿足當(dāng)前臨床需求，由于侵襲性真菌病發(fā)病兇險(xiǎn)、確診困難、病原體耐藥、病情進(jìn)展快、預(yù)后不佳、治療不良反應(yīng)較多及費(fèi)用高等特點(diǎn)，其診斷和治療一直是困擾臨床工作的難點(diǎn)之一[10-11]。早期診斷、及時(shí)治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵，意義重大[12]。雖然近年來IFD診斷技術(shù)不斷進(jìn)步和新型抗真菌藥物不斷面世，但I(xiàn)FD發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法如真菌培養(yǎng)鑒定、鏡檢、G實(shí)驗(yàn)和GM實(shí)驗(yàn)等均不夠理想，組織病理學(xué)檢查雖為IFD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其存在一定的創(chuàng)傷性而不被大多數(shù)患者所接受。此外，組織病理學(xué)檢查靈敏度較低且獲取標(biāo)本困難，對(duì)于有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者往往不易進(jìn)行等缺陷，制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用。充分利用現(xiàn)代先進(jìn)的檢驗(yàn)手段，加強(qiáng)病原學(xué)監(jiān)測(cè)，提高早期診斷率，近年來，隨著分子檢測(cè)水平的快速發(fā)展，國內(nèi)外大量學(xué)者將IFD的早期診斷寄希望于PCR法，并進(jìn)行了一系列研究，目前已取得了較大進(jìn)展，但仍存在許多問題，如方法學(xué)未標(biāo)準(zhǔn)化，缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，周圍環(huán)境中真菌無處不在，如何才能有效控制其對(duì)標(biāo)本的污染等[13]。關(guān)于PCR技術(shù)在IFD早期檢測(cè)應(yīng)用方面，有的學(xué)者認(rèn)為該方法尚不成熟，尚需更多的研究加以完善；有的學(xué)者認(rèn)為當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)了足夠的專有技術(shù)，當(dāng)前可以考慮進(jìn)行大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)。本課題組的研究表明多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，可以提高IFD的診斷率和陰性除外價(jià)值[14]，尤其是PCR法具有檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，其陰性除外價(jià)值更加有價(jià)值。本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上建立了針對(duì)煙曲霉的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法(探針法)，本實(shí)驗(yàn)過程中陰性對(duì)照標(biāo)本與待測(cè)標(biāo)本按1∶10的比例進(jìn)行全程監(jiān)控，有效監(jiān)控因污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的情況。與先前所建立的熒光染料法相比，探針法具有更高的特異度，有利于將來臨床的推廣應(yīng)用。與通用PCR法相比，實(shí)時(shí)PCR法可以實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量，可為臨床區(qū)分真菌的感染和定植提供依據(jù)，為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療初步奠定基礎(chǔ)，且實(shí)時(shí)PCR法擴(kuò)增完成后結(jié)果分析過程中無需開蓋操作，大大降低了實(shí)驗(yàn)室PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染事件的發(fā)生率，該方法具有較好的臨床應(yīng)用前景，其不足之處在于所建立的實(shí)時(shí)PCR法只能用于煙曲霉菌的檢測(cè)，且如果煙曲霉相關(guān)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，煙曲霉菌將不能被檢出。目前臨床上確診IFD的方法對(duì)專業(yè)技術(shù)要求高，且結(jié)果的判斷帶有主觀性，耗時(shí)長，導(dǎo)致早期確診困難；與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法相比，PCR法具有更高的檢測(cè)靈敏度，在IFD的早發(fā)現(xiàn)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，PCR法有助于早診斷、早治療，明顯改善疾病預(yù)后，且有效減少不必要的抗生素濫用。有研究認(rèn)為，長期使用廣譜抗生素，可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞釋放過氧化物減少，繼而其破壞真菌菌絲細(xì)胞壁的有效性大大降低，更容易導(dǎo)致IFD的發(fā)生[8]。此外，抗真菌藥物品種相對(duì)較少、不良反應(yīng)大且價(jià)格昂貴，經(jīng)驗(yàn)性用藥與精準(zhǔn)醫(yī)療的潮流不符，且容易引起醫(yī)患矛盾，因此探索出一種快速準(zhǔn)確的IFD早期檢測(cè)方法，為臨床的診斷和治療提供依據(jù)，具有重要的意義。分子生物學(xué)方法應(yīng)用于IFD的檢測(cè)，有助于提高IFD診斷水平，應(yīng)用前景良好[15]，但仍需進(jìn)行大規(guī)模、多中心的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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Preliminary exploration on clinical application value of aspergillus fumigatus fluorescence probe real-time PCR method*

XINGZhifang1,CAOGuojun2△,ZHAOZhen3,ZHAOHongying4,PANHuifen3,XIAJianhong3

(1.DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedMinhangHospital,FudanUniversity,Shanghai201199,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedMinhangHospital,FudanUniversity,Shanghai201199,China;4.WeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261053,China)

Objective To establish a probe real-time polymerase chain reaction(PCR) method for aspergillus fumigatus and to preliminarily explore its clinical application value.Methods The special genome sequence of aspergillus fumigatus served as the target for designing corresponding primers and probe and establishing the PCR reaction system.This method was preliminarily applied in the detection of clinical sputum and plasma samples for verifying its detection performance.Results The established real time PCR method for aspergillus fumigatus had good sensitivity and specificity.The method showed good effect in detecting the clinical sputum and plasma samples.Conclusion The established fluorescence probe real-time PCR method for aspergillus fumigatus has good effect in preliminary application of clinical sputum and plasma sample detection.But its practical clinical value still needs to be verified by a larger sample.

aspergillus fumigatus; probe real-time PCR method; clinical use

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年項(xiàng)目(20154Y0141)；上海市閔行區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)自然基金項(xiàng)目(2015MHZ003;2016MHZ01)；上海市閔行區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)基金項(xiàng)目(2014MW13)。

邢志芳，女，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷研究?！?/p>

，E-mail:gjcao@foxmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.003

A

1673-4130(2016)24-3391-02

2016-09-10

2016-10-28)