核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應(yīng)用

曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心　518035)

·臨床研究·

核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應(yīng)用

曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心518035)

目的研究核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測中的應(yīng)用價值。方法選取2006年6月至2012年6月深圳市347 160例血清學(xué)檢測陰性的獻血者血液標(biāo)本為研究對象，對其實施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查、PCR-微流芯片法、實時熒光PCR法及NOVARTIS TMA進行核酸篩查以統(tǒng)計攜帶有HBV的血液標(biāo)本數(shù)量，同時，所有獻血者追蹤檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乙型肝炎兩對半標(biāo)志物。結(jié)果347 160例血清學(xué)檢測陰性的獻血者通過實施核酸檢測，共檢測出乙型肝炎表面抗原陰性及HBV-DNA陽性129例，占0.37‰。其中，窗口期19例，占檢出總例數(shù)14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。結(jié)論NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻血者血液標(biāo)本中攜帶的HBV，對保障血液安全具有重要意義，值得在今后臨床檢測工作中積極推廣使用。

核酸擴增技術(shù)；乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原；脫氧核糖核酸

輸血是將獻血者的血液通過靜脈輸注的方式傳輸至患者體內(nèi)，以起到良好的輔助治療作用的一種治療方法，在當(dāng)前醫(yī)療機構(gòu)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在獻血者中，乙型肝炎病毒感染組不可避免地夾雜其中，對輸血者的身體健康帶來了極大的隱患。根據(jù)當(dāng)前醫(yī)學(xué)臨床研究可知，乙型肝炎病毒(HBV)是一種脫氧核糖核酸病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[1]。目前在我國境內(nèi)HBV感染率約為65%，而乙型肝炎表面抗原攜帶率約占到了總?cè)丝跀?shù)的7%，乙型肝炎病毒(HBsAg)屬于傳染性疾病，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為嚴重的全球性衛(wèi)生問題。如何有效降低由血液輸注造成的HBV感染率已經(jīng)成為各國醫(yī)學(xué)界專家學(xué)者研究的重要課題。在血液標(biāo)本檢測工作中，核酸擴增技術(shù)(NAT)可縮短檢測“窗口期”，降低漏檢感染病毒率等優(yōu)點日漸凸顯，并且此種方法已經(jīng)成為西方發(fā)達國家病毒篩查工作的重要手段之一[2]。為此，本研究針對核酸檢測方法在血液HBV-DNA檢測的應(yīng)用價值展開深入分析，以為該種檢測技術(shù)的推廣使用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取深圳市血液中心2006年6月至2012年6月347 160例血清學(xué)檢測為陰性的獻血者為研究對象，其中男185 470例，占53.4%，女161 690例，占46.6%，獻血者年齡18～45歲，平均(31.5±2.5)歲。所有無償獻血者均檢測HIV、梅毒陰性；ABO血型根據(jù)紅細胞表面有無特異性抗原(凝集原)A和B來劃分血液類型系統(tǒng)；血液檢測標(biāo)本均是在全密閉狀態(tài)下采集的。排除非研究區(qū)間段提供的血液標(biāo)本，以及含有乙醇成分的血液標(biāo)本。

1.2檢測方法347 160例獻血者血液標(biāo)本進行HBsAg金標(biāo)試紙法，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)采用干化學(xué)法測試，合格后將采集到的血液標(biāo)本置于NAT試管中，以3 000 r/min離心15 min，并放置在4 ℃環(huán)境中保存[3]。選定后實施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法、PCR-微流芯片法、實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法及NOVARTIS TMA進行HBV-DNA檢測。(1)羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法。首先對檢測血液標(biāo)本進行核酸全自動提取工作，將所使用的純化試劑洗滌緩沖液、蛋白裂解液、磁珠等放置在瑞士羅氏COBAS AMPLICOR NAT檢測儀上，于匯集池將標(biāo)本均勻混合后取樣500 μL,并且經(jīng)過陰陽對照之后放入到儀器，等待1 h后提取自動完成的核酸[4]。其次，向標(biāo)本加入Mn2+溶液和純化之后的核酸樣液，根據(jù)NAT檢測儀檢測步驟要求逐次加入變性液、內(nèi)標(biāo)、酶和顯色劑自動完成擴增和檢測工作，之后由操作人員記錄標(biāo)本的陽性檢測結(jié)果。(2)PCR-微流芯片法。本研究中采用上海浩源生物科技有限公司生產(chǎn)的PCR檢測試劑盒，擴增引物為HBV前C及C區(qū)設(shè)計引物，正反向擴增引物的序列如下所示：5′-TTG CCT TCT GAC TTC TTT CC-3′,5′-CGA GGG AGT TCT TCT TCT AG-3′。擴增的具體循環(huán)條件為：50 ℃環(huán)境下120 s；95 ℃環(huán)境下預(yù)變性5 min，94 ℃ 50 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s 2個循環(huán)，90 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s共32個循環(huán)[5]。使用DNA500微流芯片來檢測PCR擴增物。利用Caliper L 1000微流芯片分析儀實施HBV定量檢測，并利用檢測儀攜帶的計算軟件計算最終檢測結(jié)果[6]。(3)實時熒光PCR法。本研究中所使用的PCR混合物包括正向引物(nt1743～1434)5′-ACG TCC TTT GTT TAC GTC GCG T-3′和反向引物(nt1743～1722)5′-CCC AAC TCC TCG CAG TCC TTA A-3′。擴增程序：50 ℃環(huán)境下溫育120 s，94 ℃ 120 s、60 ℃ 30 s 1個循環(huán)，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共39次循環(huán)，在60 ℃條件下進行熒光PCR定量分析[7]。(4)NOVARTIS TMA。采用Novartis Procleix Ultrio Discriminatory TMA對待檢測血液標(biāo)本進行HBV-DNA檢測，檢測樣品嚴格按照世界衛(wèi)生組織國際標(biāo)準(zhǔn)品HBV(97/750)進行校準(zhǔn)。(5)HBV陽性結(jié)果的追蹤研究。進行乙型肝炎兩對半，ALT檢測，HBsAg同時用兩種ELISA試劑測定，陽性結(jié)果用中和實驗確證。

1.3質(zhì)量控制每天室內(nèi)質(zhì)控物由試劑公司合作配置，按試劑說明書要求判讀結(jié)果有效性。2007年開始參加原衛(wèi)生部和澳大利亞的室間質(zhì)評(NRL，2011年后更改為CITAC)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Stata11.0統(tǒng)計軟件進行處理數(shù)據(jù)及統(tǒng)計學(xué)分析，分類變量資料采用Fisher法，連續(xù)變量資料采用兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1核酸檢測結(jié)果所有347 160例獻血者通過實施核酸檢測，共檢測出HBsAg陰性、HBV-DNA陽性129例，占0.37‰[95%置信區(qū)間(CI)為1∶3 224～1∶2 265，P<0.05]。其中，羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，95%CI為1∶9 124～1∶1 999；實時熒光PCR法檢出11例，95%CI為1∶11 779～1∶2 831；PCR-微流芯片法檢出3例，95%CI為1∶22 831～1∶1 611；NOVARTIS TMA多核酸檢測107例，95%CI為1∶2 463～1∶1 671。

2.2HBsAg陰性及HBV-DNA陽性血清學(xué)標(biāo)志物分布情況本研究共檢測出HBsAg陰性，HBV-DNA陽性129例。其中，處于窗口期19例，占檢出總例數(shù)的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染中乙型肝炎核心抗體(HBcAb)陽性及乙型肝炎表面抗體(HBsAb)50例，占38.8%；HBcAb陽性及HBsAb陽性45例，占34.9%；單純HBsAb陽性15例，占11.6%。

2.3對核酸陽性結(jié)果獻血者的追蹤結(jié)果129例HBV-DNA陽性獻血者進行了追蹤，成功追蹤到42例獻血者，其中7例獻血者追蹤到HBsAg血清轉(zhuǎn)換到陽性的現(xiàn)象，且HBcAb轉(zhuǎn)換為陽性，呈窗口期特征，占總例數(shù)的18.0%。

2.4室間質(zhì)評結(jié)果2007年開始每年參加原衛(wèi)生部臨檢中心的質(zhì)評，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。澳大利亞的NRL共15支編號A～O，按要求與血液標(biāo)本同等檢測，2007年參加3次，其中HBV-DNA、HCV RNA與預(yù)期結(jié)果完全一致。HIV RNA 第2次N號標(biāo)本為B亞型稀釋標(biāo)本，首次未檢出，后改進探針后檢出。2008年參加3次，全部符合，其中第一次L號為HBV和HIV合并感染，HIV載量低于目前所有的檢測方法，本實驗室均檢出。2008年后均為100.0%符合。

3討論

HBV是一種經(jīng)血傳播，且危害極大的一種病毒性傳染病，而引起HBV傳播的途徑主要有以下幾種：血源性傳播、醫(yī)源性傳播、母嬰傳播、生殖細胞傳播、密切接觸傳播(性接觸為主)、吸血昆蟲(蚊子、臭蟲等)傳播等[8]。隨著病毒防治及健康宣教工作的廣泛開展，生殖細胞傳播、密切接觸傳播、吸血昆蟲傳播等途徑所導(dǎo)致的HBV傳播率得到了有效控制。因而，血源性傳播已經(jīng)成為乙型肝炎的主要傳播途徑。特別是當(dāng)前輸血治療在醫(yī)療機構(gòu)的各個科室中已經(jīng)得到了廣泛的使用，更是進一步加劇了HBV防治工作的壓力。

當(dāng)前我國范圍內(nèi)的大部分血站一直在單純使用ELISA，并將HBsAg作為HBV感染的獻血者篩查手段與指標(biāo)。但是，血液標(biāo)本檢測過程中由于窗口期、低水平乙型肝炎感染、基因變異等客觀因素的存在，使獻血者篩查工作并沒有取得理想效果，現(xiàn)代輸血安全的需要得不到有效滿足[9]。所以，如何降低血站血液標(biāo)本中HBV“窗口期”感染風(fēng)險已經(jīng)成為血液檢測領(lǐng)域亟待解決的問題。

經(jīng)過不斷開展的臨床研究證實，人體一旦遭受到外界病毒感染，通常情況下最先被檢測出來的就是病毒核酸。HBV-DNA為乙型肝炎的脫氧核糖核酸，即HBV基因，是當(dāng)前臨床判定乙型病毒性肝炎感染的最直接、特異性較強及反應(yīng)靈敏度較高的指標(biāo)。如果獻血者血液標(biāo)本經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)HBV-DNA結(jié)果呈陽性，則提示該獻血者體內(nèi)存在著HBV復(fù)制和潛在傳染性。而HBV-DNA越高則表示病毒基因復(fù)制越嚴重，傳染性隨之提升[10]。因此，通過檢測HBV-DNA已經(jīng)成為篩選血站血液標(biāo)本HBV感染，以及提高輸血安全性的關(guān)鍵手段。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，國外醫(yī)學(xué)界已經(jīng)廣泛采用NAT來縮短病毒基因檢測的“窗口期”，實現(xiàn)及時篩查出HBV感染的血液標(biāo)本的目的。相較于ELISA等血清學(xué)檢測方法，核酸檢測將HBV檢測的 “窗口期”由原來的50 d縮短至25 d，血液安全由此可得到更好保障。國外將其應(yīng)用在臨床血液檢測工作中的報道已經(jīng)屢見不鮮。

本研究對347 160例陰性血樣獻血者在不同時間段分別采用羅氏PCR法，PCR-微流芯片法和實時熒光PCR法及NOVARTIS TMA進行血液核酸常規(guī)篩查。共檢出129例HBV-DNA陽性標(biāo)本，陽性總比率為1∶2 691，占0.37‰，明顯高于西方發(fā)達國家，主要原因是我國為肝炎的高發(fā)區(qū)，人群中HBsAg攜帶率為7.18%，HBV流行率高達60%以上。本次檢出129例HBV-DNA陽性，其中羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，實時熒光PCR法檢出11例，PCR-微流芯片法檢出3例，NOVARTIS TMA多核酸檢測107例?？迫A半自動方法由于前期采用離心富集病毒方法，該方法富集病毒效果差，檢出比率相應(yīng)比其他方法低。而NOVARTIS TMA方法由于采用單人份檢測，上樣量為500 μL，檢出的陽性比率較其他方法高。其余方法由于標(biāo)本采集時間、取樣量、提取和擴增方法不同，檢出比率稍有不同。盡管各種檢測方法檢出例數(shù)存在著一定程度的差異，但是不可否認的是相較于臨床常用的ELISA，其診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性更高，對于臨床廣泛使用的輸血治療起到了有效的保障。進一步研究發(fā)現(xiàn)，檢測出的129例HBsAg陰性、HBV-DNA陽性獻血者，其中，窗口期患者19例，占檢出總例數(shù)的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染獻血者中HBcAb陽性及HBsAb陰性50例，占38.8%；HBcAb陽性及HBsAb陽性45例，占34.9%；單純HBsAb陽性15例，占11.6%，進一步證實了現(xiàn)有檢測方法存在的弊端與不足。

然而，結(jié)合國內(nèi)外既有研究成果及本科室工作經(jīng)驗，提示NAT推廣使用需要解決以下兩個問題：首先是持續(xù)維持核酸檢測運行經(jīng)費問題。NOVARTIS TMA核酸檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果是上述檢測方法中最佳的，但是該系統(tǒng)與國內(nèi)目前血站實驗室檢測系統(tǒng)存在著明顯的數(shù)據(jù)信息對接問題，缺乏足夠的配套資金開展相應(yīng)的研究。其次，需要明確一個符合標(biāo)準(zhǔn)的實驗室規(guī)范化檢測流程并做好核酸檢測實驗室質(zhì)量控制和人員的技術(shù)培訓(xùn)工作。由于NAT在國內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用，各地區(qū)醫(yī)療從業(yè)人員對其認知與操作步驟存在一定的不足，需要在此方面花費較大精力予以妥善解決。

綜上所述，NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻血者血液標(biāo)本中攜帶的HBV，對血液安全起到了重要的保障作用，值得在今后臨床檢測工作中積極推廣使用。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.041

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1673-4130(2016)12-1695-03