環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)中的應用研究

王韋華，劉桂梅（陜西省渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714000）

環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)中的應用研究

王韋華，劉桂梅
（陜西省渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714000）

隨著科學技術的進步，畜牧獸醫(yī)中對動物的檢測技術有了很大的進步，一種名為環(huán)介導等溫擴增技術的分子生物檢測技術，憑借著特異性強、敏感度高、操作方便快捷等特點，正在受到越來越多生物醫(yī)學研究者所關注。研究表明，將環(huán)介導等溫擴增技術英語畜牧獸醫(yī)的檢測當中有著非常重要的實際意義。因此，本文主要就環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)中的應用進行了研究，介紹了環(huán)介導等溫擴增技術的技術原理，分析了環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)的實際應用思路，希望通過此次研究為環(huán)介導等溫擴增技術未來的深入研究和應用提供參考和借鑒。

環(huán)介導等溫擴增技術；畜牧獸醫(yī)；應用

環(huán)介導等溫擴增技術是2000年由日本研究者Notomi等人在綜合前人的發(fā)展成果的基礎上開發(fā)了一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技。環(huán)介導等溫擴增技術基本原理是針對六個特定區(qū)域設計四條特殊引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在60～65 ℃的溫度范圍內實現對核酸的有效擴增。因此，憑借著環(huán)介導等溫擴增技術具有特異性強、敏感度高、操作方便快捷等特點，將環(huán)介導等溫擴增技術應用于畜牧獸醫(yī)當中將在無需借助昂貴的儀器設備的情況，更快更準確的對動物疫病做出檢測［1］。

1　環(huán)介導等溫擴增技術的簡介

環(huán)介導等溫擴增技術針對靶序列六個特定區(qū)域，我們需要設計四條特殊引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）在60～65 ℃條件下催化新鏈合成，從而達到短時間內對核酸有效擴增的目的。其中四條特殊的引物分為兩對內外引物。在環(huán)介導等溫擴增的反應中，內引物與目標DNA交雜，開始互補鏈的合成，產生啞鈴狀的DNA，這種合成持續(xù)延伸，進而形成莖環(huán)DNA結構，成為環(huán)介導等溫擴增循環(huán)的起始結構。具體是內引物夾雜在莖環(huán)DNA結構上，使得引物鏈置換合成的有缺口的中間媒介，莖上附這的便是目標序列，然后，通過外引物，在莖的末端合成環(huán)狀結構，周而復始，便在同一DNA鏈上形成諸多花椰菜結構的莖環(huán)DNA機構。我們對經過環(huán)介導等溫擴增后的混合物進行電泳，由于擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰菜樣結構的DNA片段混合物，其在電泳后在凝膠上會呈現出不同大小區(qū)帶的階梯式圖譜，我們可以通過對圖譜的不同顯示情況來判斷動物的疫病情況，從而達到對動物的檢測。

2　環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)領域的應用

首先，環(huán)介導等溫擴增技術可以用于動物真菌的檢測。一直以來，病毒都是導致動物生病和死亡的主要原因，因此在畜牧獸醫(yī)中對動物病毒的檢測是動物疫病防治的只要工作之一。在畜牧獸醫(yī)中對于動物危害最為普遍的便是禽流感，由于畜牧業(yè)動物都比較集中，一旦發(fā)生禽流感往往會給牧民造成巨大的經濟損失。傳統(tǒng)的禽流感病毒的檢測一般是采取病毒分離的檢測方法，檢測周期長過長一直是次檢測方法發(fā)主要弊端，此外我們也可以常規(guī)PCR等核酸診斷技術的方法對病毒進行檢測，雖然這種檢測方法敏感性高，但往往需要用到昂貴且操作復雜的儀器和試劑，對于畜牧獸醫(yī)中臨床現場檢測的實現比較困難。而在畜牧獸醫(yī)中應用環(huán)介導等溫擴增技術，就能極大提高動物病毒檢測的速率，且操作方便快捷，無需借助昂貴的檢測儀器便可實現。在對豬圓環(huán)病毒檢測時，根據豬圓環(huán)病毒與基因組的構成針對PCV2引入四對特異性引物，在60 ℃的情況下對幼崽豬進行環(huán)介導等溫擴增，若60 min內發(fā)生反應這證明PCV2的存在，反之則不存在。以此方法從而達到對幼崽豬PCV2的快速簡單的檢測，且這種檢測方法靈敏度高，與豬的PCV1、豬偽狂犬病毒以及豬細小病毒的檢測無干擾，確保了PCV2病毒檢測的準確性［2］。

其次，環(huán)介導等溫擴增技術可以用于動物細菌的檢測。動物細菌的感染也是動作致病的一大原因之一，其中如產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）不僅是導致人生病的一大細菌，也是導致動物疾病產生的一大原因。傳統(tǒng)的細菌檢測方法一般是采取將細菌分離方法以達到檢測的目的，這種方法不僅操作復雜，花費的時間比較久，且檢測結果容易與其他型大腸桿菌的影響［3］。

最后，環(huán)介導等溫擴增技術可以用于動物真菌的檢測。在畜牧獸醫(yī)中我們常常會遇到真菌檢測，比如奔馬性赭粉菌是一種不完全真菌，這種真菌是動物性傳染病與急性真菌感染的一大根源，其對貓和鳥動物的中樞神經系統(tǒng)和呼吸道的危害最為巨大，對用畜牧業(yè)的影響也是非常大。因此，在對動物真菌檢測是，我應用環(huán)介導等溫擴增技術針對奔馬性赭粉菌DNA中LSU rDNA序列的特定區(qū)域設計特異性引物，應用于環(huán)介導等溫擴增技術對其進行檢測，這種方法準確且迅速，檢測結構不易受到其他真菌的影響。

3　結束語

從上我們不難發(fā)現，在畜牧獸醫(yī)中應用環(huán)介導等溫擴增技術，其主要是利用病毒、細菌和真菌等DNA的特異性，引入特殊引物對其進行環(huán)介導等溫擴增反應，這種技術不僅對動物病毒、細菌和真菌的檢測方便迅速，且檢測結構比起傳統(tǒng)檢測方法更為準確可靠。

［1］彭永剛，孫恩成，劉飛，等.環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)領域的應用［J］.中國獸醫(yī)科學，2010，（5）.

［2］劉寶山，潘樹德，尹榮煥，等.環(huán)介導等溫擴增技術在畜禽疾病診斷中的應用［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，（7）.

［3］楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，等.環(huán)介導等溫擴增技術及其在動物疫病診斷中的應用［A］.上海是畜牧獸醫(yī)學會［C］，2011.

（編輯：李善祥）

S851.6

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1006-799X（2016）13-0011-02