細菌磷壁酸的免疫調控作用及與其結構的關系

高權新　彭士明　張晨捷　姚　震　張　慧　施兆鴻*

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海200090；

2.德州職業(yè)技術學院，德州253034；3.天津市濱海新區(qū)

大港農業(yè)服務中心獸醫(yī)站，天津300270)

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細菌磷壁酸的免疫調控作用及與其結構的關系

高權新1彭士明1張晨捷1姚震2張慧3施兆鴻1*

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海200090；

2.德州職業(yè)技術學院，德州253034；3.天津市濱海新區(qū)

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摘要：磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁的重要組分，在致病菌誘發(fā)炎癥和益生菌免疫調控過程中擔當重要作用，并保持了細菌的多種生理功能，現已成為當今的研究熱點。本文對致病菌磷壁酸的免疫刺激作用、益生菌磷壁酸的免疫調控作用、敲除磷壁酸基因對細菌的影響、磷壁酸結構及其與功能的關系進行綜述，旨在為磷壁酸的研究與應用提供新線索。

關鍵詞：磷壁酸；免疫調節(jié)；結構

早期對細菌的研究主要將整個細菌作為研究對象，隨著研究的深入，人們開始探索菌體成分的理化功能。磷壁酸是革蘭氏陽性菌特有的膜成分，主要由16～40個磷酸二酯鍵連接而成的甘油組成。磷壁酸的結構是由疏水部分(通過磷酸二酯鍵與細胞膜結合的類脂)和親水部分(磷酸甘油酯)組成，所以磷壁酸屬于雙性體分子物質。磷壁酸是一類病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，能夠特異性激活動物的Toll樣受體2(TLR2)信號傳導通路，從而誘發(fā)一系列的免疫應答反應[1]。不同的細菌，尤其是致病菌與益生菌之間，其磷壁酸的免疫特性有很大的差別。益生菌的磷壁酸大多具有益生特性，而致病菌的磷壁酸往往具有致病性。這種功能特性上的差異是由磷壁酸不同的結構引起的[2]，所以磷壁酸的功能特點和結構具有種的特異性。

磷壁酸是革蘭氏陽性菌發(fā)揮生理功能的重要表面分子，其保持了細菌原有的多種生物學活性。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的磷壁酸能夠降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平、提高促凋亡蛋白Bax的表達水平和半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活力，從而誘導人的成骨細胞樣細胞(human osteoblast-like cells)的凋亡、壞死[1]。研究發(fā)現，磷壁酸還具有抗畜禽病毒的作用，是一種潛在的防治病毒的“藥物”[3]。此外，眾多專家學者從組織、器官及整體水平上證明了雙歧桿菌磷壁酸具有延緩衰老的作用[4]。磷壁酸具有的免疫特性正在被一步步的發(fā)掘出來，所以深入解析磷壁酸的功能特性及其結構對于疾病的防治和豐富對細菌的認識等都具有重要的意義。

1致病菌磷壁酸的免疫刺激作用

致病菌會誘導寄主細胞表達、分泌大量的炎性因子，從而引發(fā)炎癥，對組織細胞造成損傷。磷壁酸是革蘭氏陽性菌的重要免疫刺激成分，能誘導產生大量炎性因子的表達。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是一類與蛀齒有關的致病菌，能夠引起牙髓發(fā)炎。研究發(fā)現，變異鏈球菌的磷壁酸能夠通過激活小鼠巨噬細胞的TLR2信號傳導通路，誘發(fā)炎癥反應[5]。Ahn等[6]發(fā)現，金黃色葡萄球菌(Staphylococusaureus)磷壁酸能夠通過激活小鼠巨噬細胞的TLR2和細胞內模式識別受體2(NOD2)誘導環(huán)氧化酶-2(COX-2)的過量表達，從而誘發(fā)炎癥反應。Huang等[7]發(fā)現金黃色葡萄球菌的磷壁酸能夠誘導大鼠神經膠質細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2、血紅素氧合酶1(HO-1)的表達，激活絲裂原活化蛋白激酶(p38)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路，活化轉錄因子核轉錄因子κB(NF-κB)和轉錄激活因子1(AP-1)，并對寄主細胞造成損傷。鑒于磷壁酸對致病菌的生理機能及傳染特性具有重要的作用，眾多專家學者已經著手于研制能夠抑制致病菌合成磷壁酸的藥物，將磷壁酸作為藥物靶點，抑制磷壁酸的合成，從而達到防治致病菌感染的效果[8]。

2益生菌磷壁酸的免疫調控作用

磷壁酸保留了益生菌原有的免疫調控作用，能夠增強寄主的免疫功能。福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)的肽葡聚糖能夠活化NF-κB，激活單核細胞，從而誘發(fā)嚴重的免疫反應，最終會引發(fā)腸道疾病和克羅恩病等。Kim等[9]發(fā)現植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的磷壁酸能夠緩解由福氏志賀氏菌肽葡聚糖誘發(fā)人單核(THP-1)細胞的過度免疫反應，降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達量，抑制NF-κB和細胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的活化，從而增加寄主細胞的免疫耐受力。Noh等[10]發(fā)現植物乳桿菌的磷壁酸能夠通過抑制人腸道細胞TLR2的活力并阻止Pam2CSK4(TLR2激動劑)引起的p38、JNK和NF-κB的活化，從而抑制嚴重的炎癥反應。植物乳桿菌磷壁酸與金黃色葡萄球菌磷壁酸相比，對THP-1細胞的免疫刺激作用較弱，并能夠抑制金黃色葡萄球菌磷壁酸誘導的血小板活化因子受體(PAFR)、TLR2、Toll樣受體4(TLR4)、CD14(脂多糖受體)的表達，從而發(fā)揮免疫保護作用[11]。

益生菌磷壁酸的免疫調控作用，因細菌種類的不同而存在差異。Kaji等[12]發(fā)現干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)能夠誘導小鼠巨噬細胞炎性因子白細胞介素-12(IL-12)的表達，僅刺激少量炎性抑制因子白細胞介素-10(IL-10)的表達(IL-10是炎癥與免疫抑制因子，能夠抑制過度的炎性反應)；但是植物乳桿菌磷壁酸能夠抑制干酪乳桿菌誘導的IL-12的表達，顯著增加IL-10的含量，這一改變有助于維持細胞的正常狀態(tài)，減少細胞損傷。Jeong等[13]分別提取了植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、Lactobacillusdelbreukii、沙克乳桿菌(Lactobacillussakei)K101的磷壁酸，發(fā)現植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的磷壁酸能夠適度的刺激大鼠巨噬細胞264.7細胞產生炎性因子，但是Lactobacillusdelbreukii、沙克乳桿菌K101卻刺激產生了大量的炎性因子，并誘發(fā)了嚴重的免疫反應。經分析發(fā)現，這些細菌磷壁酸的糖脂結構是由不同種類、不同長度的脂肪鏈組成；不同的乳桿菌磷壁酸所具有的免疫調控能力存在著差異，這是由磷壁酸的特有結構決定的。

3敲除磷壁酸基因對細菌的影響

益生菌能夠治療炎性腸疾病(inflammatory bowel diseases,IBD)，這種治療作用備受關注。Mohamadzadeh等[14]、Grangette等[15]、Claes等[16]分別將嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的磷壁酸基因敲除，結果發(fā)現這些敲除了磷壁酸基因的益生菌具有了更有效的免疫調節(jié)作用。嗜酸乳桿菌磷壁酸突變株(敲除磷壁酸基因)與野生菌相比，具有更強的免疫調控作用：顯著降低了小鼠樹狀突細胞IL-12、TNF-α的表達量，增加炎性抑制因子IL-10的含量，阻止了CD4(+)T細胞的活化，從而抑制了過度的炎性反應[14]。植物乳桿菌磷壁酸突變株與野生菌相比，能夠更顯著地降低小鼠外周血單核細胞IL-12、TNF-α以及干擾素-γ(IFN-γ)的分泌量，增加IL-10的表達量；臨床試驗發(fā)現，植物乳桿菌磷壁酸突變株與野生菌相比，能夠更有效地治療小鼠的大腸炎[15]。此外，植物乳桿菌磷壁酸突變株與野生菌相比，還具有抑制大鼠內臟疼痛感知(visceral pain perception)的作用[17]。鼠李糖乳桿菌磷壁酸突變株與野生菌相比，亦能更有效地治療小鼠的大腸炎，其過程伴隨著IL-12、TLR2、IFN-γ表達量的降低[16]。益生菌磷壁酸突變株與野生菌相比，對寄主細胞的負面損傷減小[18]，并且具有更有效的益生作用。敲除磷壁酸對細菌自身的生長、形態(tài)、細胞分裂以及細胞壁的形成等都有顯著的影響。研究發(fā)現，鼠李糖乳桿菌磷壁酸突變株的菌體長度增加，隔膜不易成形，耐酸堿能力下降等[19]；植物乳桿菌磷壁酸突變株的菌體長度增加，細胞不易分裂，自溶率增加，肽聚糖水解酶的表達量發(fā)生變化等[20]。敲除磷壁酸基因后的細菌，其形態(tài)結構、繁殖力、免疫調控功能等理化特性都發(fā)生了改變，這些改變必然關乎益生菌對寄主的益生作用，其詳細的作用特點有待進一步研究確定。

4磷壁酸的結構及與其功能的關系

磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁的特有結構和重要組分，由核糖醇或甘油殘基經磷酸二酯鍵相互連接而成的陰離子聚合物，其鏈上羥基大多由丙氨酸或N-乙酰葡萄糖胺修飾，通常帶有一定量的負電荷，形成正負電荷交替出現的鏈狀聚合物結構。雖然革蘭氏陽性菌磷壁酸皆具有一個相似的基本結構，但是不同種類的細菌磷壁酸存在著差異。低胞嘧呤(G)+鳥嘌呤(C)含量的革蘭氏陽性菌(硬壁菌門)磷壁酸有2條脂肪酸“尾巴”的疏水鏈錨入細胞膜中，還有1條長的帶有電荷的親水鏈分布在不同的區(qū)域，其電荷的特點與菌種有關。大多細菌磷壁酸的親水區(qū)域是1條由1,3-磷酸二酯鍵連接的甘油-磷酸基團多聚化合物，并有D-丙氨酸或糖基修飾。疏水鏈大多是1個糖基鏈，一般是由葡萄糖基(Glc)(β1-6)修飾的甘油二酯[21]。

金黃色葡萄球菌和鏈球菌是能夠引起膿毒病的致病菌，經研究發(fā)現金黃色葡萄球菌的磷壁酸有30～50個多聚甘油-磷酸(poly-Gro-P)，其主要由D-丙氨酸和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)修飾。Stadelmaier等[22]采用人工化學合成的方法合成了磷壁酸的類似化合物，即(D-丙氨酸)4(N-乙酰氨基葡萄糖)1(甘油-磷酸)6；研究發(fā)現，合成的磷壁酸類似物能夠誘導炎性因子的分泌，與天然的磷壁酸具有相似的免疫刺激作用[22-23]。D-丙氨酸和甘油-磷酸對磷壁酸的免疫調節(jié)具有較大的影響，而N-乙酰氨基葡萄糖的作用卻可以忽略；將D-丙氨酸轉換成L-丙氨酸后，磷壁酸的免疫刺激作用顯著降低[22]。

乳酸菌的磷壁酸有多聚D-丙氨酸結構，其錨入細胞膜的糖脂是由三己糖-甘油二酯組成。許多乳酸菌，諸如干酪乳桿菌YIT9029、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)YIT0159都能誘導寄主細胞促炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)的表達；而植物乳桿菌卻只誘導少量促炎性因子的表達。此外，研究發(fā)現，從植物乳桿菌磷壁酸突變株分離提取的磷壁酸與野生菌的磷壁酸相比，其誘導的促炎性因子的表達量也較少。這可能是由于突變菌磷壁酸的D-丙氨酸和糖基的結構、數量以及甘油-磷酸鏈的長度的改變引起的[20]。與金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的磷壁酸相比，植物乳桿菌幾乎不會刺激264.7細胞產生一氧化氮(NO)，而且活化TLR2/CD14的程度較弱，誘導產生的TNF也較少[24]。不僅如此，植物乳桿菌磷壁酸還可減少金黃色葡萄球菌誘導的TNF的表達，抑制脂多糖誘導單核細胞分泌TNF，治療脂多糖引起的小鼠的內毒素休克癥，緩解弗累克斯訥氏桿菌(Shigellaflexneri)肽聚糖誘發(fā)的炎性反應[9,25-26]。對比分析金黃色葡萄球菌和植物乳桿菌的磷壁酸發(fā)現，兩者的最大不同點是在磷壁酸糖脂部分中?；湹娘柡统潭?植物乳桿菌的不飽和脂肪酸)和數量(植物乳桿菌的第三?；?，還有甘油-磷酸鏈的糖基取代物；二者具有相似的D-丙氨酸[4]。由此可見，磷壁酸的脂鏈(酰基鏈的長度以及飽和程度)和甘油-磷酸鏈(D-丙氨酸和糖基)在磷壁酸發(fā)揮免疫刺激及調控方面具有的重要作用。

5小結

從國內外的文獻中可以看出，磷壁酸作為革蘭氏陽性菌細胞壁的重要組分，在細菌誘發(fā)炎癥、免疫調控中的作用，以及與其結構特點的關系已逐被闡明，這使細菌作用特點及機理的研究已逐步深入到在細菌組分層面的探索，然而許多問題仍需要進一步的探討和解答。比如，益生菌的磷壁酸具有免疫調控的功能，許多專家也指出，磷壁酸可作為免疫佐劑；但是亦有許多文獻指出，益生菌的磷壁酸被基因敲除后，具有了更好的免疫調控作用，這之間存在著矛盾，需要開展相關的研究進行分析和鑒定。

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(責任編輯菅景穎)

Teichoic Acid from Bacteria in Immune Regulation and Its Relationship to Structure

GAO Quanxin1PENG Shiming1ZHANG Chenjie1YAO Zhen2ZHANG Hui3SHI Zhaohong1*

(1.Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture,East Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090,China; 2. Dezhou Vocational and Technical College, Dezhou 253034, China; 3. Veterinary Station of Dagang, Agricultural Service Center of Binhai New Area of Tianjin,Tianjin 300270, China)

Abstract:Teichoic acid is one of the major components of cell wall of Gram-positive bacteria, and plays important roles in pathogenic bacteria-induced inflammation and immune regulation of probiotics and has a variety of physiological functions of bacteria, which has become the hotspot of the research today. The roles of teichoic acid of pathogenic and probiotic bacteria in immune stimulation and regulation, the effects of knockout of teichoic acid gene on bacteria, structure of teichoic acid and its relationship to function were reviewed and summarized. This review will supply new clues for further study and application of teichoic acid.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：15-19]

Key words:teichoic acid; immune regulation; structure

*Corresponding author, professor, E-mail: shizhh@hotmail.com

中圖分類號：S917.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)01-0015-05

作者簡介：高權新(1982—)，男，山東淄博人，助理研究員，博士，主要從事海水魚類養(yǎng)殖研究。E-mail： gaoqx2008@163.com*通信作者：施兆鴻，研究員，碩士生導師，E-mail： shizhh@hotmail.com

基金項目：國家自然科學基金項目(31502206)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費(東2014Z02-2)

收稿日期：2015-07-01

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.003