正常家兔左心室三層心肌Cx43表達(dá)的異質(zhì)性研究

鐘江華，陳小盼，陸士娟，黃珊，黃康，張偉，劉正旺

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院心血管內(nèi)科，海南 ?？?570208；2.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102)

·論 著·

正常家兔左心室三層心肌Cx43表達(dá)的異質(zhì)性研究

鐘江華1，2，陳小盼2，陸士娟1，黃珊2，黃康1，張偉1，劉正旺2

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院心血管內(nèi)科，海南 海口 570208；2.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南 海口 570102)

目的 觀察正常家兔三層心肌間跨室壁縫隙連接蛋白43(Cx43)分布的差異，探討惡性室性心律失常(MVA)的發(fā)生機(jī)制。方法檢測(cè)并對(duì)比正常家兔左心室三層心肌間的單相動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)程(APD90)以及Cx43蛋白(Cx43-pro)和mRNA(Cx43-Cq)的表達(dá)差異。結(jié)果(1)正常家兔三層心肌間APD90存在差別，中層心肌(233.80±19.37)組織APD90均長于心內(nèi)膜(201.20±18.72)和心外膜下(202.70±19.91)心肌組織(P＜0.05)，說明家兔三層心肌間存在跨室壁復(fù)極的離散；(2)正常家兔三層心肌間的Cx43-pro[(0.58±0.08)vs(0.47±0.04)vs(0.57±0.07)]與Cx43-Cq[(24.61±2.82)vs(22.18±2.62)vs(24.43±3.31)]差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中層心肌較心內(nèi)膜與心外膜下心肌組織表達(dá)減少，表明家兔三層心肌間存在跨室壁Cx43表達(dá)的異質(zhì)性。結(jié)論正常家兔中層心肌與心內(nèi)外膜下心肌間存在Cx43蛋白表達(dá)不均一，這是左心室存在心肌橫斷面上復(fù)極離散的蛋白基礎(chǔ)。

家兔；惡性室性心律失常；縫隙連接蛋白43；復(fù)極離散；中層心肌

惡性室性心律失常(MVA)是臨床常見的急危重癥，患者常常發(fā)生心臟驟停而致心源性猝死(SCD)。在低血鉀、心肌梗死、心力衰竭等病理?xiàng)l件下，MVA發(fā)生率明顯增加，故此探討MVA的發(fā)生機(jī)制有重要的臨床意義。近年來，有研究認(rèn)為MVA的發(fā)生與跨室壁復(fù)極離散相關(guān)[1]，中層心肌的單相動(dòng)作電位時(shí)程(APD)尤其是復(fù)極時(shí)程明顯較心內(nèi)外膜下延長，使心肌存在跨室壁的復(fù)極離散，有誘發(fā)早期后除極(EAD)、延遲后除極(DAD)和觸發(fā)活動(dòng)并在室壁橫斷面內(nèi)折返形成MVA如尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等。但跨室壁復(fù)極離散的蛋白機(jī)制并不清楚。

縫隙連接蛋白Cx43是介導(dǎo)左心室肌細(xì)胞間電流傳導(dǎo)的主要導(dǎo)體[2-3]，本研究通過觀察家兔離體心臟左心室心肌單相動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和Cx43的跨室壁異質(zhì)性，探討MVA的蛋白分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制作 選擇健康家兔20只，體重2.0～3.0 kg，雌雄不限。

1.2 實(shí)驗(yàn)中相關(guān)的溶液制備 用改良的臺(tái)氏液進(jìn)行心臟離體灌流，其成分主要包：HEPES 5 mmol/L，NaH2PO41 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，NaCl 115 mmol/L，MgCl21 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，并用NaOH將制備溶液的pH值調(diào)配為7.4[4]。準(zhǔn)備好eppendorf管，將1 mmol/L EGTA，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L芐脒，1 μmol/L胃酶抑素，1 μmol/L亮肽素，1 mmol/L碘乙酰胺，100 nmol/L抑肽酶，1 mmol/L PMSF，以及pH8.0的緩沖液分別加入試管[5]。

1.3 離體心臟電生理實(shí)驗(yàn) 參照既往實(shí)驗(yàn)方法[4]進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 電生理實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 將離體后的心臟放入4℃臺(tái)氏液中修剪，稱量重量后立即插管給予進(jìn)行Langendorff灌流(恒壓8.52～8.78 kPa，恒溫36.5℃～37.5℃，純氧飽和)。

1.3.2 電生理實(shí)驗(yàn) 起搏電極由兩支針形電極組成，兩針相距0.5 cm，在心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處刺入。參比電極固定于主動(dòng)脈根部，將三個(gè)自制的簡易電極通過注射針頭插入左室心肌層，調(diào)整電極位置，使之分別位于心內(nèi)外膜下0.5 mm處及距心外膜面距離3.0 mm處。將簡易電極全部與生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)連接，以500～1000 Hz為濾波參數(shù)。用心電生理刺激儀以1 000 ms的起搏周長固定起搏。穩(wěn)定20 min后同步記錄三層心肌組織的單相動(dòng)作電位。

1.4 左心室三層心肌組織提取 電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剪取家兔的左心室心肌游離壁，通過快速冰凍切片的方法分別采集心內(nèi)外膜下心肌和中層心肌組織(連續(xù)切片10次，每片20 μm，共200 μm)[5]。將切取的三層心肌組織放入預(yù)先準(zhǔn)備的Eppendorf管內(nèi)并液氮冷凍保存。

1.5 Western-blot檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá) 分別將采集的家兔各層心肌組織勻漿、提取組織蛋白后根據(jù)逐個(gè)上樣，凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，將PVDF膜放入5% TBST脫脂牛奶中封閉2 h，滴加Cx43單克隆抗體(Zymed 35-5000)后4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Novogene公司)后繼續(xù)室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后顯影于X線膠片上。獲取蛋白質(zhì)信號(hào)圖像后，分別測(cè)定目的蛋白Cx43和內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度(OD)值，以兩者的比值作為Cx43蛋白的表達(dá)水平[4]。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)Cx43 mRNA表達(dá) 將eppendorf管中各組左心室冷凍組織樣本研成粉末狀，提取心肌組織總RNA，用RevertAid First Strand反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA，再行qPCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)比。上游引物：5′-GAGGTGGCCTTCTTGCTGAT-3′，下游引物：5′-GTTTTCTCAGTGGGGCGAGA-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度122 bp。GAPDH上游引物：5′-AGAGCACCAGAGGAGGACGA-3′，下游引物：5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAGG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度104 bp。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：42℃60 min，70℃5 min。qPCR反應(yīng)參數(shù)：50℃3 min，95℃15 min，95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。qPCR擴(kuò)增過程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，分析、計(jì)算qPCR過程各檢測(cè)樣本熒光信號(hào)能被檢測(cè)到的循環(huán)閾值(CT值)，并通過2-ΔΔCT法計(jì)算樣本的Cx43 mRNA表達(dá)差別倍數(shù)(Cq值)以代表Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 檢測(cè)指標(biāo) (1)APD復(fù)極90%時(shí)程(APD90)：單相動(dòng)作電位從0期復(fù)極至振幅下降90%的時(shí)間距離。(2)Cx43-pro：左心室各層心肌組織Cx43蛋白表達(dá)水平。(3)Cx43-Cq：左心室各層心肌組織Cx43 mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)資料為完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間差異的顯著性比較。如果方差齊同，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊則用Tamhane檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 左心室三層心肌APD參數(shù) 正常家兔三層心肌間APD90存在差別，中層心肌組織APD90要長于心內(nèi)膜和心外膜下心肌組織，說明家兔三層心肌間存在跨室壁復(fù)極的離散，見表1。

表1 左心室三層心肌間電生理參數(shù)和Cx43表達(dá)比較(±s，n=20)

表1 左心室三層心肌間電生理參數(shù)和Cx43表達(dá)比較(±s，n=20)

注：與心內(nèi)外膜下比較，aP＜0.05；Endo：心內(nèi)膜下心肌，Mid：中層心肌，Epi：心外膜下心肌。

組別Cx43-mRNA APD90Cx43-pro Endo Mid Epi 24.61±2.82 22.18±2.62a24.43±3.31 201.20±18.72 233.80±19.37a202.70±19.91 0.58±0.08 0.47±0.04a0.57±0.07

2.2 左心室三層心肌Cx43蛋白和mRNA表達(dá)比較 正常家兔左心室中層心肌的Cx43-pro與Cx43-Cq均較心內(nèi)膜和心外膜下心肌組織減少(P＜0.05)，而心內(nèi)膜和心外膜下心肌間無明顯差別，表明Cx43蛋白和mRNA在正常家兔左心室心肌橫斷面上的分布存在異質(zhì)性，這種異質(zhì)性主要是由于中層心肌Cx43表達(dá)的明顯減少所導(dǎo)致，見表1和圖1。

圖1 左心室三層心肌間Cx43-pro表達(dá)比較

圖2 左心室三層心肌間Cx43-Cq表達(dá)比較

3 討 論

MVA通常指持續(xù)性室性心動(dòng)過速、心室撲動(dòng)、心室顫動(dòng)等，常常在各種器質(zhì)性心臟病如心力衰竭、心肌梗死等時(shí)發(fā)生，是導(dǎo)致心源性猝死(SCD)的急危重心律失常。在中國每年約有數(shù)十萬人死于SCD，由于MVA的發(fā)生較為急劇，預(yù)測(cè)和治療存在很大的困難，因此深入探討其電生理和蛋白分子機(jī)制，具有重要的治療及應(yīng)用價(jià)值。

先前的基礎(chǔ)心電生理研究已經(jīng)證實(shí)，心肌不同部位的復(fù)極不均一性是MVA發(fā)生的重要機(jī)制。犬的缺血模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)顯示，缺血區(qū)域心肌的APD較周邊的正常心肌明顯縮短，導(dǎo)致心肌存在空間上的復(fù)極時(shí)程差異，這種時(shí)程長短的差別可以形成一個(gè)閉合的環(huán)形折返環(huán)[6]。病理?xiàng)l件下，當(dāng)心肌受到損害刺激而發(fā)生電的觸發(fā)時(shí)，電信號(hào)將可以通過這個(gè)折返環(huán)在正常心肌和缺血心肌間不斷往返而發(fā)生MVA。Wu等[7]的研究進(jìn)一步證實(shí)這種環(huán)形的折返途徑也可以發(fā)生于左心室壁的橫斷面上，即心內(nèi)外膜下和中層心肌間。動(dòng)物研究已經(jīng)表明，家兔及人的中層心肌APD明顯較心內(nèi)外膜下心肌延長，特別是復(fù)極2相和3相延長為主，使其容易發(fā)生早期后除極，而且APD長短的不均一必然形成心肌層橫斷面上的電流梯度，從而可以不斷折返而形成MVA。我們的結(jié)果也表明，正常家兔左心室三層心肌的APD長短并不一致，存在心室肌內(nèi)的復(fù)極時(shí)程離散。

導(dǎo)致中層心肌跨室壁復(fù)極離散的蛋白分子機(jī)制尚未完全闡明。但是既往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)，Cx43是參與MVA發(fā)生的主要蛋白分子，當(dāng)左心室心肌Cx43蛋白表達(dá)減少時(shí)，心電的傳導(dǎo)速度也明顯變慢，表現(xiàn)為心電圖的QRS波增寬[8]。另外，Cx43在心肌組織的空間與數(shù)量分布上還存在差異，從而增加電生理的不穩(wěn)定性[9]。因此，Cx43的表達(dá)變化是許多病理?xiàng)l件下心電異常的解剖基礎(chǔ)。我們的結(jié)果還表明，與心內(nèi)外膜下心肌比較，正常家兔左心室中層心肌的Cx43表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)，導(dǎo)致左心室心肌存在橫斷面上的跨室壁Cx43表達(dá)不均一，這可能是左心室心電存在跨室壁復(fù)極離散的解剖基礎(chǔ)。我們推測(cè)，在某些病理?xiàng)l件及藥物作用下，這種Cx43蛋白的表達(dá)不均一性將進(jìn)一步擴(kuò)大，繼而促使心電的不穩(wěn)定性增加，尤其是各層心肌間復(fù)極時(shí)程的差異程度變大，進(jìn)而容易誘發(fā)后除極及壁內(nèi)折返而發(fā)生MVA。

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Transmural heterogeneity of Cx43 expression in three myocardial layers of rabbit.

ZHONG Jiang-hua1,2,CHEN Xiao-pan2,LU Shi-juan1,HUANG Shan2,HUANG Kang1,ZHANG Wei1,LIU Zheng-wang2.1.Department of Cardiology, the Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.The Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the change of transmural heterogeneity of connexin 43(Cx43)protein among three myocardial layers and explore physiological mechanisms of malignant ventricular arrhythmia(MVA) in normal rabbit.Methods90%monophasic action potential repolarization duration(APD90),transmural dispersion of repolarization(TDR)and Cx43 protein(Cx43-pro)and mRNA(Cx43-Cq)expression among three myocardial layers were measured in normal rabbit.Results(1)APD90was different among three myocardial layers in normal rabbit,and APD90in the midmyocardium(233.80±19.37)was significantly prolonged than those in the subendocardium(201.20±18.72)and subepicardium(202.70±19.91)(P＜0.05),which showed that transmural dispersion of repolarization was existed among three myocardial layers.(2)Compared to those in the subendocardium and subepicardium, Cx43-pro[(0.58±0.08)vs(0.47±0.04)vs(0.57±0.07)]and Cx43-cq[(24.61±2.82)vs(22.18±2.62)vs(24.43±3.31)]expression in the midmyocardium was significantly decreased(P＜0.05),which indicated that there was transmural expression heterogeneity of Cx43 protein among three myocardial layers.ConclusionTransmural heterogeneity of Cx43 expression exists among three myocardial layers in rabbit,which may cause dispersion of repolarization.

Rabbit;Malignant ventricular arrhythmia(MVA);Cx43;Dispersion of repolarization;Midmyocardium

R-332

A

1003—6350（2016）04—0517—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.04.001

2015-10-15)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81160024)；海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：814371)

陸士娟。E-mail：zhong3882@163.com