兔膝OA腔內(nèi)注射牛膝多糖對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

邱蕓 姜勇 梅芳

【摘 要】 目的：探討關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射牛膝多糖液對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率的影響。方法：造模成功后，實(shí)驗(yàn)兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射牛膝多糖液0.4ml，右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入玻璃酸鈉0.4ml，每周1次，共4次。于0、15、30d各處死12只實(shí)驗(yàn)兔，觀察軟骨細(xì)胞凋亡及凋亡率。結(jié)果：治療前各組細(xì)胞凋亡率比較無明顯差異（P>0.05）；治療第15天各組與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療第30天各組與治療前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：牛膝多糖能夠更好的促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)，具有很好的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 牛膝多糖；膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；凋亡率

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）22-0014-02

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性骨關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨退變及軟骨下骨變化為主要特征[1]。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生以膝、髖部最為常見，且在60歲以上中老年人群的膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)49%[2]。研究分析關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射牛膝多糖液對(duì)玻璃酸鈉骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率的影響，探討牛膝多糖對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6～8月齡新西蘭雄性大白兔36只，體重2.0kg左右，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部提供。動(dòng)物合格證號(hào)：江西醫(yī)動(dòng)證字第04106-01號(hào)，SPF級(jí)。

1.1.2 儀器與試劑 XYS-13型熒光顯微鏡（上海上光新光學(xué)科技有限公司）；CCK-8-1000T型細(xì)胞周期與凋亡試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司）。

1.1.3 藥品 中藥懷牛膝（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院中藥房提供并鑒定）。粉碎過目，放入多功能提取罐，先加入蒸餾水400 L提取2次，藥物殘?jiān)偌诱麴s水300L提取2次；提取液合并濃縮，然后加入3倍量乙醇進(jìn)行純化，得白色沉淀物，沉淀經(jīng)干燥得牛膝多糖粗提物，進(jìn)一步使用乙醇純化，得牛膝多糖純化物；將純化物配成相當(dāng)生藥4 g的水溶液放冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 動(dòng)物進(jìn)行左右側(cè)造模膝骨性關(guān)節(jié)炎，左膝為治療組，右膝為對(duì)照組。

1.2.2 造模 采用改良Hulth模型造模，取符合要求的36只雄性新西蘭白兔，用3%戊巴比妥鈉以30mg/g劑量對(duì)動(dòng)物耳緣靜脈注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，雙膝關(guān)節(jié)局部脫毛，備皮，消毒，關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)進(jìn)行長(zhǎng)4cm左右縱切口，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，保留后交叉韌帶，保護(hù)軟骨面，徹底止血，清理縫合及固定。術(shù)后1周內(nèi)每天強(qiáng)迫動(dòng)物進(jìn)行30min超疲勞活動(dòng)，共觀察3個(gè)月。然后進(jìn)行X線觀察顯示有明顯的關(guān)節(jié)腔狹窄及骨刺形成，以獲得骨性關(guān)節(jié)炎模型[3]。

1.2.3 給藥 造模成功后的第1天，實(shí)驗(yàn)左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療物牛膝多糖液0.4ml，右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入對(duì)照藥物玻璃酸鈉0.4ml，每周1次，共4次。實(shí)驗(yàn)的第0、15、30天分別處死12只試驗(yàn)兔，取材后進(jìn)行軟骨細(xì)胞凋亡觀察，并觀察動(dòng)物的日常總體狀況，測(cè)量體重，并作相關(guān)記錄。

1.2.4 觀察指標(biāo)及方法 將關(guān)節(jié)軟骨組織冰凍切片后，用4%多聚甲醛溶液在室溫下固定20min，然后加入細(xì)胞通透液（0.1%TritonX-100+0.1%枸櫞酸鈉）后加入PBS液洗2次，擦片后加入50μl TUNEL反應(yīng)混合液，在37℃溫箱內(nèi)加蓋孵育60min，PBS洗3次后，置于熒光顯微鏡下觀察（見圖1），有熒光顯色者可確認(rèn)為具有細(xì)胞凋亡特征。放大400倍進(jìn)行觀察，以100個(gè)軟骨細(xì)胞為單位，計(jì)算凋亡的數(shù)目統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。平均每切片觀察5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)其平均凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

治療前兔軟骨細(xì)胞凋亡率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療第15天各組與治療前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明牛膝多糖與玻璃酸鈉治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎都有效，兩者效果無明顯區(qū)別。治療第30天與治療前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且治療組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明牛膝多糖與玻璃酸鈉治療效果有明顯區(qū)別，且牛膝多糖優(yōu)于玻璃酸鈉。見表1、圖1。

3 討論

《本草綱目》記載牛膝“苦、酸，平，無毒。治…傷折。牛膝乃足厥陰、少陰藥。所主之病，大抵得酒則能補(bǔ)肝腎，生則能去惡血”?！侗窘?jīng)》稱其“治寒濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血?dú)?，…久服輕身耐老”。牛膝多糖是牛膝中含量較高的活性成分，藥理研究證明，牛膝多糖在調(diào)節(jié)免疫、抗衰老等[4]方面活性顯著。張利等[5]運(yùn)用補(bǔ)腎活血湯治療膝骨性關(guān)節(jié)，顯示補(bǔ)腎活血湯（包括牛膝）對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)疼痛有明顯的療效；陳元娜[6]研究發(fā)現(xiàn)川牛膝多糖高劑量組有促進(jìn)細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫功能的作用，表明牛膝多糖具有一定增強(qiáng)免疫功能的作用。另外，牛膝多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變具有保護(hù)作用[7]；牛膝對(duì)重型顱腦損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用[8]。

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）嚴(yán)重程度和軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量之間存在著重要的相關(guān)性[9]，OA中凋亡軟骨細(xì)胞的比例增高，說明在0A中細(xì)胞凋亡的確在發(fā)揮作用[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示牛膝多糖對(duì)兔OA軟骨細(xì)胞凋亡有正向調(diào)節(jié)的作用，可以減少細(xì)胞的凋亡率，這可能是牛膝多糖能夠促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)的機(jī)制，說明牛膝多糖對(duì)于防治OA具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2015.08.06）