代謝組學(xué)在食醋研究中的應(yīng)用進(jìn)展

朱宇 李旭

食醋是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品之一，我國的釀醋歷史可以追溯至2200年前，食醋還具有抗菌、抗感染、抗氧化、控制血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減肥、抗癌等保健功能。由于品系龐雜，釀制過程中的原料和工藝各不相同，暫時沒有統(tǒng)一法定的分類方法。根據(jù)新國標(biāo)規(guī)定，食醋可分為“釀造食醋”和“配制食醋”。食醋在釀造過程中多使用糧食作為原料，發(fā)酵過程中的微生物變化過程復(fù)雜，而代謝組學(xué)具有靈敏度高、檢測范圍廣等特點(diǎn)，因此可以用于分析食醋發(fā)酵過程中特征物質(zhì)的變化。

20世紀(jì)末，英國倫敦大學(xué)的Jeremy Nicholson創(chuàng)立了代謝組學(xué)（metabbonmics）概念。隨著核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜（liquid chromatography，LC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、質(zhì)譜（mass spectrograph，MS）、超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）及多種聯(lián)用分析技術(shù)的出現(xiàn)，代謝產(chǎn)物、代謝途徑等相關(guān)研究得到發(fā)展?；蚪M百科全書、Mass Bank數(shù)據(jù)庫、METLIN數(shù)據(jù)庫、人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫等作為信息聯(lián)動平臺，促進(jìn)了代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的分析。本文基于代謝組學(xué)在食醋研究中的應(yīng)用進(jìn)展，對不同代謝組學(xué)分析方法及應(yīng)用開展綜述，并篩選分析方法，以期為順利開展項(xiàng)目工作提供理論依據(jù)。

一、代謝組學(xué)分析技術(shù)

代謝組學(xué)以多種代謝路徑的底物、產(chǎn)物的小分子質(zhì)量代謝物（相對分子質(zhì)量＜1000）為研究對象，分析技術(shù)包括氣相色譜、高效液相色譜、超高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振及聯(lián)用技術(shù)等。由于待測樣品多種多樣，檢測需求各不相同，且代謝產(chǎn)物復(fù)雜，因此應(yīng)嘗試多種聯(lián)用方式進(jìn)行測定，以獲得更靈敏、更高效、更準(zhǔn)確的測定效果。在靶向代謝組學(xué)分析過程中，高分辨率儀器比三重四極桿具備更好的定量效果。而在非靶向代謝組學(xué)研究中，高分辨率質(zhì)譜具備更高的靈敏度，能夠在復(fù)雜混合物中對痕量級代謝物進(jìn)行分析鑒定。

1.核磁共振分析技術(shù)。核磁共振作為最常見的光譜分析技術(shù)，具有高度可重復(fù)性，通過整合質(zhì)子NMR信號識別代謝物，能夠分析難以電離、需衍生化或濃度極高的化合物。對分子量較小的代謝物進(jìn)行高通量測試，只需要對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理即可，具有對樣品破壞性小、信息豐富等特點(diǎn)。核磁共振氫譜（1H-NMR）無技術(shù)偏向，使用范圍最為廣泛。李占明等在 H-NMR無損檢測原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法，對其在食品溯源分析及摻假中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了論述。雖然核磁共振波譜在對化合物鑒定方面不具備優(yōu)勢，但是可以通過和MS聯(lián)用，同位素標(biāo)記追蹤，結(jié)合化學(xué)信息技術(shù)，通過多元數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘等方式，進(jìn)一步提高NMR檢測的優(yōu)勢。在對葡萄酒、蜂蜜、水稻、核桃、榛子、辣椒的產(chǎn)地溯源研究以及油菜蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品的檢測等方面，具備高效、準(zhǔn)確的技術(shù)優(yōu)勢。

核磁共振的缺點(diǎn)是檢測靈敏度較低，目標(biāo)分析物分析速度慢，無法對不存在于數(shù)據(jù)庫中的未知物進(jìn)行定性定量，對含量相差較大的物質(zhì)難以同時檢測。當(dāng)然，隨著磁體技術(shù)、應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記等方式的發(fā)展，NMR的應(yīng)用范圍會進(jìn)一步擴(kuò)大。

磁共振光譜（MRS）可用于體內(nèi)研究，高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HR MAS）可用于完整組織樣本研究，二維核磁共振光譜（2D NMR）可以用于代謝物的鑒定等。Boguszewicz ?等利用MRI/MRS系統(tǒng)采集光譜，利用PLS-DA進(jìn)行分析，揭示了多發(fā)性硬化亞型質(zhì)檢的代謝產(chǎn)物特征。Tilgner M等重點(diǎn)介紹了HRMAS核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)的方案，證明核磁共振波譜能夠以高光譜分辨率評估完整組織的代謝產(chǎn)物譜。Lhoste C等總結(jié)了2D NMR的概念、特點(diǎn)和局限性，描述了其在混合物分析中的主要應(yīng)用。

2.質(zhì)譜分析技術(shù)。核磁共振通常應(yīng)用于代謝組學(xué)指紋圖譜研究，而基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法通常是靶向分析的最佳方案。核磁共振波譜的最大優(yōu)勢是非破壞性和非入侵性，而質(zhì)譜則在分析次級代謝物方面具有強(qiáng)大優(yōu)勢，并隨著不同的電離技術(shù)發(fā)展，可以增加代謝物檢測的數(shù)量。近年來，質(zhì)譜技術(shù)高速發(fā)展成為最核心前沿的技術(shù)手段，飛行時間（TOF）、軌道阱質(zhì)譜、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等儀器則為代謝分析提供了不同靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率的MS技術(shù)選擇。

二、代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法

主成分分析（ principal components analysis，PCA）是分析統(tǒng)計(jì)方法之一，但是沒有相關(guān)的概率模型，難以評估PCA與數(shù)據(jù)的擬合度，而且不能正確提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)視圖，也不能合理處理缺失的數(shù)據(jù)，存在限制性。

偏最小二乘判別分析（ partial least squares discriminant nalysis，PLS-DA）是常見的降維分析方法，而正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）則用于兩組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的判別，已有研究指出這些方法存在局限性。例如，PLS-DA易過度擬合，可能產(chǎn)生錯誤結(jié)果，因此需要提出一些新的統(tǒng)計(jì)分析方法來克服這些限制。

Kim等開發(fā)了MetaPCA和稀疏MetaPCA框架，該框架可以結(jié)合多個組學(xué)數(shù)據(jù)集來識別一個共同的特征空間進(jìn)行降維。Nyamundanda等引入了概率主成分和協(xié)變量分析，有助于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)和協(xié)變量的聯(lián)合建模，提供對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的見解。

三、代謝組學(xué)在食醋研究中的應(yīng)用進(jìn)展

食醋中含有多種營養(yǎng)成分，選擇不同的生產(chǎn)原料，運(yùn)用不同的發(fā)酵釀造方法，可以生產(chǎn)出不同類型、風(fēng)味、口味的醋類產(chǎn)品。應(yīng)用代謝組學(xué)分析研究食醋產(chǎn)品，能夠?qū)ζ錉I養(yǎng)及安全性進(jìn)行有效評價，也可利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究食醋發(fā)揮的生物學(xué)功能和保健作用。

在食醋的代謝組學(xué)分析方法的建立方面，Camin F等在多方實(shí)驗(yàn)室合作研究下，對葡萄酒醋樣品、蘋果醋樣品、香醋樣品進(jìn)行了測試，計(jì)算樣品的重復(fù)性和再現(xiàn)性，驗(yàn)證官方認(rèn)定的檢測方法。李愛平等采用核磁共振（1H-NMR）代謝組學(xué)方法對比氨基酸分析儀測定結(jié)果，分析不同種類食醋的差異性代謝物，結(jié)果一致。于博學(xué)等利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法測定食醋中的對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙脂，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性好。李愛平等建立了基于核磁共振（1H-NMR）和模式識別食醋的分析方法，為不同食醋的功效成分研究提供了參考。F. PinuF等建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），對意大利香醋進(jìn)行代謝組學(xué)研究。

應(yīng)用代謝組學(xué)對食醋進(jìn)行質(zhì)量評估和風(fēng)味分析，可以檢測篩選不同品種、不同產(chǎn)地和不同釀造方式食醋的特征成分和生物標(biāo)志物。首先，風(fēng)味是評價食醋的重要指標(biāo)，尤其是食醋中的揮發(fā)性成分，楊晰等利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)食醋香味主要由3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪、糠醛和乳酸乙酯所帶來。FR Pinu等通過三種GC-MS方法準(zhǔn)確識別123種代謝物，包括25種氨基酸、26種羧酸、13種糖和糖醇及47種以上的芳香化合物，并且鑒定出5種未知揮發(fā)性代謝物。Zhang G等與四川太源井醋業(yè)有限公司合作，通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)比較鎮(zhèn)江香醋、山西陳醋、太源井曬醋、思坡曬醋、保寧醋，采用LC-MS/MS和GC-MS質(zhì)譜聯(lián)用方法研究醋的揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分，共發(fā)現(xiàn)89種揮發(fā)性成分和488種非揮發(fā)性成分，經(jīng)過OPLS-DA分析后，發(fā)現(xiàn)太源井曬醋的8種揮發(fā)性特征物質(zhì)和18種非揮發(fā)性特征成分，并檢測出多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物。Kim E J等通過代謝組學(xué)研究酒精發(fā)酵和乙醇發(fā)酵兩個階段所產(chǎn)生的生物活性化合物，進(jìn)而評估兩個階段的發(fā)酵對最終代謝產(chǎn)物含量的影響。其次，產(chǎn)地、品種和釀造方式都對食醋的品質(zhì)具有重要影響，Minhye Shin等利用代謝組學(xué)技術(shù)研究了韓國傳統(tǒng)食醋和商品食醋代謝產(chǎn)物的不同。李陽利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)篩選了江蘇食醋、山東食醋和山西食醋中的差異代謝物和生物標(biāo)志物，篩選了淺色食醋和濃色食醋之間的差異代謝物和標(biāo)志代謝物。楊曉璇利用代謝組學(xué)研究了食醋的揮發(fā)性組分和非揮發(fā)性組分，篩選尋找了不同食醋之間的差異性代謝物，并對不同食醋的成分差異做出綜合分析和評價。李藝?yán)么x組學(xué)技術(shù)研究了山西老陳醋指紋圖譜和功能成分。這些實(shí)驗(yàn)一方面對食醋的特征性成分和生物標(biāo)志物進(jìn)行了分析，另一方面可利用代謝物信息對傳統(tǒng)食醋和釀造食醋進(jìn)行區(qū)分，同時可判斷食醋中是否存在外源添加物，以便進(jìn)行食醋的溯源、質(zhì)量鑒定和品質(zhì)評價。

在利用代謝組學(xué)研究食醋成分與生物學(xué)功能方面，代謝組學(xué)技術(shù)常被研究者用來分析給予食醋后動物血清和尿液等代謝物的變化，并通過生物信息學(xué)分析動物體內(nèi)差異代謝物所影響的代謝通路等信息，進(jìn)而判斷食醋發(fā)揮的生物學(xué)功能。李愛平等采用基于核磁共振氫譜的代謝組學(xué)技術(shù)，對山西陳醋灌胃后大鼠的血清和尿液代謝物進(jìn)行了研究，通過KEGG通路富集分析提出山西陳醋具有抗疲勞、降糖、降脂等保健功能。李藝?yán)么x組學(xué)技術(shù)研究了給予不同陳釀期山西醋后大鼠血清代謝物的變化，驗(yàn)證了食醋促進(jìn)能量代謝、抗疲勞、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能。Ning Z等采用GC-MS結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)方法，分析兩種醋的化學(xué)成分，確定33種潛在生物標(biāo)志物，最終證明米醋和白醋都有促進(jìn)血液循環(huán)的生物活性。

四、結(jié)語及展望

本文綜述了代謝組學(xué)主要分析方法在食醋行業(yè)中的應(yīng)用發(fā)展，利用非靶向和靶向代謝組學(xué)相結(jié)合的方式，分析了揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分。通過對不同生產(chǎn)企業(yè)的食醋進(jìn)行橫向比較，篩選差異性代謝物，富集分析代謝途徑等，研究發(fā)酵工藝及原料選擇，并對不同省份的食醋產(chǎn)品進(jìn)行分析研究。通過對比篩選特征代謝產(chǎn)物，研究微生物代謝產(chǎn)物的變化情況，為選擇優(yōu)勢菌株、改善工藝、提升食醋品質(zhì)、開展食醋產(chǎn)地溯源工作、服務(wù)地方監(jiān)管需求等提供了技術(shù)支撐。

2018年6月2日，國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)管總局發(fā)布了GB 2719-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食醋》標(biāo)準(zhǔn)，并于2019年12月21日正式實(shí)施。市場監(jiān)管總局采取了一系列專項(xiàng)活動貫徹落實(shí)，例如深入開展食醋生產(chǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)整治活動、食醋生產(chǎn)加工小作坊專項(xiàng)整治活動等，使食醋產(chǎn)業(yè)責(zé)任主體意識明顯加強(qiáng)，質(zhì)量明顯提升，生產(chǎn)能力顯著提高。

為進(jìn)一步促進(jìn)食醋企業(yè)研發(fā)實(shí)力提升以及經(jīng)濟(jì)效益得到一定增長，引起社會對食品安全的進(jìn)一步關(guān)注，提高企業(yè)研發(fā)者、經(jīng)營者的誠信經(jīng)營意識，提升百姓對于食品的認(rèn)知，提升食品安全社會形象，促進(jìn)食品產(chǎn)業(yè)競爭力，提升健康綠色研發(fā)意識，節(jié)約食品監(jiān)管資源，減少研發(fā)過程污染，進(jìn)一步減少生產(chǎn)污染，應(yīng)當(dāng)緊密關(guān)注相關(guān)國家知識產(chǎn)權(quán)政策、地方地理標(biāo)志保護(hù)和運(yùn)用規(guī)劃，深入挖掘具有地域特色的地標(biāo)產(chǎn)品，開展地理標(biāo)志申請和保護(hù)，有效評估其安全性和品質(zhì)，大力發(fā)展地理標(biāo)志區(qū)域性食醋品牌。

基金項(xiàng)目：甘肅省市場監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（SSCJG-SP-B202202）。

*通信作者：朱宇（1983-），男，漢族，甘肅蘭州人，工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)榈乩順?biāo)志運(yùn)用促進(jìn)。