vWF及ADAMTS13在肝臟疾病中的意義

陳亞利　許姍姍　張晶

100069　首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院

?

·綜述·

vWF及ADAMTS13在肝臟疾病中的意義

陳亞利許姍姍張晶

100069首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院

微循環(huán)障礙參與了多種疾病的進(jìn)展，例如膿毒癥、多器官衰竭等。血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)可使血小板粘附聚集于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血小板血栓形成；血管性血友病因子特異性裂解酶(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombo-spondin type I repeats 13，ADAMTS13)可裂解vWF多聚體，預(yù)防血栓形成， vWF:Ag / ADAMTS13活性比值升高常常導(dǎo)致微循環(huán)障礙，同時也是微循環(huán)障礙和微血栓形成的主要血清學(xué)標(biāo)記物。近期研究表明肝臟疾病也存在微循環(huán)障礙，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值顯著異?！，F(xiàn)對vWF:Ag / ADAMTS13活性比值與在肝臟疾病的意義及其影響因素綜述如下。

一、vWF和ADAMTS13 簡介

正常情況下，vWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，但肝損傷時，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞也可表達(dá)vWF，并促進(jìn)局部凝血過程，為最具特征性的內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)記物。vWF能夠與血小板膜GPⅠb-Ⅸ復(fù)合物及內(nèi)皮下膠原結(jié)合，介導(dǎo)血小板在血管損傷部位的黏附；與GPⅡb-Ⅲa結(jié)合，參與血小板的聚集過程；穩(wěn)定Ⅷ因子，促進(jìn)凝血過程。vWF以UL-vWF(ultralarge vWF，即vWF多聚體)形式儲存和釋放，UL-vWF促進(jìn)血小板粘附的能力最強(qiáng)。ADAMTS13是一種主要由肝星狀細(xì)胞合成和分泌的金屬蛋白酶，能在伸展的UL-vWF上的A2區(qū)切斷1605酪氨酸和1606蛋氨酸之間的肽鍵, 將其裂解為相對分子量為176 000 和 140 000大小的兩個片段，防止UL-vWF過度形成[1]。當(dāng)ADAMTS13的活性減弱而不能切斷UL-vWF，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值升高，導(dǎo)致血小板聚集形成血小板血栓，進(jìn)而引起微循環(huán)障礙[2-6]。

vWF抗原水平可利用免疫電泳法、ELISA或膠乳凝集散射比濁法對血漿進(jìn)行準(zhǔn)確定量，應(yīng)用最多的是ELISA方法。血漿中的ADAMTS13抗原水平檢測可采用ELISA方法，但是檢測其活性更有意義。第一代方法是檢測其裂解產(chǎn)物或者間接的檢測其膠原結(jié)合活性及瑞斯托菌素聚合活性。這種方法非常耗時，通常用于科學(xué)研究[7]。從1999年起，F(xiàn)urlan等人采用vWF多聚體的瓊脂糖凝膠電泳法(Furlan改良法)，此方法的可重復(fù)性高，但是也很耗時，通常需要幾天時間[2，8]。最新的方法是間接法與直接法聯(lián)合，此法可僅耗時數(shù)小時，并且具有更高的精確度和敏感性(可檢測出1%～3%的ADAMTS13的活性)、可重復(fù)性好，并且相當(dāng)省時[7，9]，是目前普遍采用的檢測方法。

二、vWF和ADAMTS13 與膿毒血癥微循環(huán)障礙和多器官功能衰竭的關(guān)系

膿毒血癥導(dǎo)致的微循環(huán)障礙和多器官衰竭(mul-tiple organ failure，MOF)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其機(jī)制研究的最透徹。Clau RA等[10]研究表明，全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者血漿vWF抗原水平隨著SIRS嚴(yán)重程度的增加而增加，ADAMTS13的活性也相應(yīng)下降，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值顯著升高。Bockmeyer CL[11]等發(fā)現(xiàn)，心肺體外循環(huán)伴有嚴(yán)重膿毒血癥患者他們也發(fā)現(xiàn)了隨著炎癥反應(yīng)的加重，ADAMTS13活性逐步下降；二者比例的顯著失衡與UL-vWF的出現(xiàn)、器官障礙和病死率有關(guān)，繼而推測SIRS導(dǎo)致ADAMTS13下降，這激活了凝血系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致MOF。其它大量研究結(jié)論與之相似，即vWF:Ag / ADAMTS13活性比值通過微循環(huán)障礙參與了膿毒血癥多臟衰的發(fā)生發(fā)展[12，13]。

三、vWF和ADAMTS13 在肝病中的臨床意義

(一)病毒性肝炎及肝硬化Uemura M等[14]對慢性病毒性肝病研究表明，ADAMTS13活性隨肝功能減退呈現(xiàn)下降趨勢：在慢性肝炎、肝硬化從Child A級到C級隨病情進(jìn)展呈降低趨勢：在慢性肝炎組為87%，肝硬化Child A、B、C級分別為79%、63%和31%，其中5例終末期肝硬化甚至小于3%。vWF抗原則隨著肝功能下降呈現(xiàn)升高的趨勢：慢性肝炎患者vWF水平較健康人增加2.5倍，肝硬化約增加3～5倍，個別Child C級患者高達(dá)10倍。vWF:Ag/ADAMTS13活性比值在健康人為1.0，在肝硬化ChildA患者為1.6，Child B 級為5.0，Child C級為16.8。另一項(xiàng)研究表明[14]，16%的肝硬化患者檢測到UL-vWF，這些患者ADAMTS13活性更低，CTP評分、肌酐和血氨更高。以上研究表明，隨著肝病的加重，肝臟微循環(huán)障礙逐漸加重，這可能參與了肝硬化及肝功能衰竭的發(fā)展。

(二)酒精性肝病酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，尤其重癥酒精性肝炎(severe alcoholic hepatitis，SAH)常合并肝性腦病、肺炎、急性腎功能不全、消化道出血等多臟器功能不全，病死率極高。Matsuyama T等[15]研究發(fā)現(xiàn)：ADAMTS13活性在肝硬化、AH和SAH中逐漸下降，分別為76%、62%和性 24%；vWF:Ag水平則顯著升高，分別為514%，405%和806%(對照組為100%)；vWF:Ag / ADAMTS13活性比值分別為8.6、8.9和102.2(對照組為1.0)。3例死于MOF的SAH患者中，ADAMTS13活性均低于16%, vWF:Ag 則高達(dá)560%以上，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值顯著升高，最高者達(dá)到240.4。在SAH和AH恢復(fù)期，ADAMTS13活性和vWF:Ag水平恢復(fù)正常，而死亡患者則沒有明顯變化。該研究表明vWF:Ag / ADAMTS13活性不僅通過誘導(dǎo)微循環(huán)障礙參與了酒精性肝炎和多器官衰竭的發(fā)生和發(fā)展，而且可以作為一個預(yù)后指標(biāo)。Uemura的研究結(jié)果與之相似[16]。

(三)肝衰竭Hugenholtz GC等[17]研究了50例急性肝損傷和急性肝衰竭患者，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)這些vWF:Ag / ADAMTS13活性比值較正常對照組顯著升高，并且患者血漿在體外能夠顯著促進(jìn)血小板聚集。ADAMTS13活性降低的患者更容易并發(fā)肝性腦病，其肝移植率和病死率更高，因而推測vWF:Ag / ADAMTS13活性比值的嚴(yán)重失衡促進(jìn)了肝衰竭患者發(fā)生多器官功能衰竭。

四、vWF和ADAMTS13水平的影響因素

(一)vWF合成增多的原因

1. 內(nèi)皮細(xì)胞功能受損vWF是內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)記物，肝病時由于肝功能減退及各種因素導(dǎo)致多種血管活性因子失調(diào)，形成心輸出量增加、低外周血管阻力的高動力循環(huán)狀態(tài)，造成血流動力學(xué)改變；腸道屏障功能受損導(dǎo)致內(nèi)毒素吸收入血，也可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致vWF釋放增多。

2. 炎癥因素Bernardo A等[18]研究了炎癥因子對UL-vWF形成的影響，并評估了炎癥與血栓形成的關(guān)系。分別應(yīng)用IL-6-sIL-6R、組胺、IL-8及TNF-α孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，上清液中UL-vWF水平分別為(12.6±4.4)，(66.0±29.7)，(47.1±11.5)和(59.6±14.9)(P<0.01)，并具有劑量依賴性。然后，采用不同濃度的IL-6、IL-8和TNF-α孵育ADAMTS13預(yù)處理的富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAMTS13 孵育的PRP，上清液中無法檢測到UL-vWF；IL-6處理組導(dǎo)致ADAMTS13 活性降低，從而抑制了UL-vWF 裂解高達(dá)50%(P<0.01)，而IL-8和TNFα處理組不能檢測到UL-vWF，說明其對ADAMTS13活性沒有影響。這些結(jié)果表明，炎性細(xì)胞因子可能刺激UL-vWF釋放(如IL-8和TNF-α)和UL-vWF裂解(如IL-6)，導(dǎo)致UL-vWF血漿中累積并黏附于內(nèi)皮的細(xì)胞，從而揭示了炎癥導(dǎo)致血栓形成的機(jī)制。Ferro D.等[19]研究發(fā)現(xiàn)vWF抗原水平與內(nèi)毒素血癥強(qiáng)相關(guān)(r=0.92;P=0.0001)，并且經(jīng)過治療內(nèi)毒素血癥好轉(zhuǎn)后，vWF水平也下降；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在體外用 125 pg/mL～500 pg/mL內(nèi)毒素培養(yǎng)時，內(nèi)皮細(xì)胞以劑量依賴的方式釋放vWF；Schorer AE等[20]采用IL-1和LPS孵育內(nèi)皮細(xì)胞1～2 h，上清液中vWF顯著增加，但內(nèi)皮細(xì)胞中vWF卻下降，表明只是二者僅誘導(dǎo)其釋放，但合成并未增加。由此可見肝硬化時內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

(二)ADAMTS13含量變化的原因

1. 肝臟合成ADAMTS13減少如前所述，ADAMTS13主要是由HSC合成，其他細(xì)胞如血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞雖然也能夠合成，但是合成量很少。Kume Y 等[21]報(bào)道HSC凋亡在ADAMTS13活性降低中發(fā)揮重要作用。用二甲基二硝銨(dimethylnitrosamine，DMN)誘導(dǎo)大鼠HSC凋亡，導(dǎo)致血漿中ADAMTS13活性顯著降低(用50 mg/kg體質(zhì)量的DMN可使其降至正常對照的40%，P<0.05)；但用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)或硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)處理的大鼠沒有發(fā)生HSC凋亡，血漿ADAMTS13活性也沒有顯著降低。還發(fā)現(xiàn)在70%肝切除的大鼠中，其HSC缺失，血漿ADAMTS13活性也降低。這均表明，HSC數(shù)量可能是影響ADAMTS13水平的因素之一。

2. ADAMTS13消耗增加在很多肝病中，vWF合成增多，處理過量的VWF抗原導(dǎo)致ADAMTS13的消耗增多，這也是肝病時ADAMTS13含量減低的重要原因之一[14-16，22]。

3. 炎癥因子與ADAMTS13的關(guān)系Uemura M等[14]研究了肝硬化患者血漿中部分炎癥因子的含量變化，發(fā)現(xiàn) Child C級肝硬化患者中ADAMTS13活性最低，血漿IL-6濃度最高，在合并感染的肝硬化患者中更加顯著。Matsuyama T[15，16]發(fā)現(xiàn)，AH患者，特別是SAH患者TNF-α、IL-8、IL-6顯著升高；ADAMTS13活性與這些炎癥因子存在相關(guān)性，提示高炎癥因子血癥可能是導(dǎo)致血漿ADAMTS13活性降低的原因之一。

4. 內(nèi)毒素抑制血漿ADAMTS13活性Reiter RA等[23]給10名男性志愿者靜脈注射2 ng/kg體質(zhì)量的內(nèi)毒素，ADAMTS13活性在4 h后(用膠原結(jié)合活性法測量)降低到基線的 (64±5)% ，(P<0.001), 24 h后仍未完全恢復(fù)(86±6)%，(P=0.008)，7 d后恢復(fù)正常。而安慰劑組各指標(biāo)無顯著變化。

5. 血漿抑制物引起血漿ADAMTS13活性降低Uemura M等[14]發(fā)現(xiàn)在83%的中度至重度ADAMTS13活性缺乏的失代償期肝硬化患者血漿中檢測到了ADAMTS13的抑制物，其水平濃度波動于0.5～1.0 BU/mL。此外，在5例終末期肝硬化病人的血漿中用WB的方法檢測到了ADAMTS13的IgG型特異性抗體，并且其ADAMTS13活性極度降低，小于正常對照組的3%。在這5例患者中，有2例為丙肝患者，乙肝、原發(fā)性膽汁性肝硬化及隱源性肝硬化患者各1例，推測丙肝患者存在的多種非器官特異性抗體中可能包括ADAMTS13特異性抗體[24-26]。

(三)影響vWF 和ADAMTS13的其他可能機(jī)制

在其他多種疾病中，對vWF 和ADAMTS13的變化也進(jìn)行了很多的研究，但是在肝病中還沒有證實(shí)。例如，Ono T等[27]在膿毒血癥誘導(dǎo)的DIC中發(fā)現(xiàn)ADAMTS13抗原降低，并且可檢測到ADAMTS13降解產(chǎn)物，表明ADAMTS13下降與其降解酶有關(guān)，而不僅僅是肝臟合成減少；Djamiatun K等[28]在研究重度登革熱時發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致WPB小體(Weibel-Palade bodies)胞吐作用增強(qiáng)，可以導(dǎo)致的循環(huán)中vWF增多；De Filippis V等[29]在研究慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)時發(fā)現(xiàn)大于10%的透析患者其vWF的Met1606位點(diǎn)氧化，導(dǎo)致UL-vWF積累，進(jìn)而聚集并激活了血小板，并且與細(xì)菌結(jié)合更牢固，導(dǎo)致了CKD患者的血栓進(jìn)展及膿毒血癥的發(fā)生，由此得出結(jié)論vWF的Met1606位點(diǎn)氧化是慢性腎功能衰竭和膿毒血癥性血栓并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素。

五、展望

盡管在膿毒血癥等多種危重疾病中關(guān)于二者含量變化的機(jī)制有很多研究，但在肝病中相應(yīng)研究還比較匱乏。目前有許多研究表明二者含量變化通過微循環(huán)障礙參與了重癥肝病的進(jìn)展，但也有相反意見。然而，幾乎所有研究都提示二者含量及活性變化與重癥肝病的不良預(yù)后密切相關(guān)。改善微循環(huán)是否能夠改善肝病的預(yù)后，還需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

1 Moake J L, Turner N A, Stathopoulos N A, et al. Involvement of large plasma von Willebrand factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. Clin Invest, 1986,78:1456-1461.

2 Furlan M, Robles R, Lammle B. Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood, 1996,87:4223-4234.

3 Dong J F, Moake J L, Bernardo A, et al. ADAMTS-13 metalloprotease interacts with the endothelial cell-derived ultra-large von Willebrand factor. Biol Chem, 2003,278:29633-29639.

4 Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, et al. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood, 2001,98:1662-1666.

5 Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, et al. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood, 2001,98:1654-1661.

6 Levy G G, Nichols W C, Lian E C, et al. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature, 2001,413:488-494.

7 Just S. Methodologies and clinical utility of ADAMTS-13 activity testing. Semin Thromb Hemost, 2010,36:82-90.

8 Sadler J E, Moake J L, Miyata T, et al. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology Am Soc Edu Program, 2004:407-423.

9 Tripodi A, Peyvandi F, Chantarangkul V, et al. Second international collaborative study evaluating performance characteristics of methods measuring the von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS-13). J Thromb Haemost, 2008,6:1534-1541.

10Claus R A, Bockmeyer C L, Budde U, et al. Variations in the ratio between von Willebrand factor and its cleaving protease during systemic inflammation and association with severity and prognosis of organ failure. Thromb Haemost, 2009,101:239-247.

11Bockmeyer C L, Claus R A, Budde U, et al. Inflammation-associated ADAMTS13 deficiency promotes formation of ultra-large von Willebrand factor. Haematologica, 2008,93:137-140.

12Martin K, Borgel D, Lerolle N, et al. Decreased ADAMTS-13 (A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeats) is associated with a poor prognosis in sepsis-induced organ failure. Crit Care Med, 2007,35:2375-2382.

13Nguyen T C, Liu A, Liu L, et al. Acquired ADAMTS-13 deficiency in pediatric patients with severe sepsis. Haematologica, 2007,92:121-124.

14Uemura M, Fujimura Y, Matsumoto M, et al. Comprehensive analysis of ADAMTS13 in patients with liver cirrhosis. Thromb Haemost, 2008,99:1019-1029.

15Matsuyama T, Uemura M, Ishikawa M, et al. Increased von Willebrand factor over decreased ADAMTS13 activity may contribute to the development of liver disturbance and multiorgan failure in patients with alcoholic hepatitis. Alcohol Clin Exp Res, 2007,31:S27-35.

16Uemura M, Matsuyama T, Ishikawa M, et al. Decreased activity of plasma ADAMTS13 may contribute to the development of liver disturbance and multiorgan failure in patients with alcoholic hepatitis. Alcohol Clin Exp Res, 2005,29:264S-271S.

17Hugenholtz GC, Adelmeijer J, Meijers JC, et al. An unbalance between von Willebrand factor and ADAMTS13 in acute liver failure: implications for hemostasis and clinical outcome. Hepatology, 2013,58:752-761.

18Bernardo A, Ball C, Nolasco L, et al. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood, 2004,104:100-106.

19Ferro D, Quintarelli C, Lattuada A, et al. High plasma levels of von Willebrand factor as a marker of endothelial perturbation in cirrhosis: relationship to endotoxemia. Hepatology, 1996,23:1377-1383.

20Schorer AE, Moldow CF, Rick M E. Interleukin 1 or endotoxin increases the release of von Willebrand factor from human endothelial cells. Br J Haematol, 1987,67:193-197.

21Kume Y, Ikeda H, Inoue M, et al. Hepatic stellate cell damage may lead to decreased plasma ADAMTS13 activity in rats. FEBS letters, 2007,581:1631-1634.

22Matsumoto M, Kawa K, Uemura M, et al. Prophylactic fresh frozen plasma may prevent development of hepatic VOD after stem cell transplantation via ADAMTS13-mediated restoration of von Willebrand factor plasma levels. Bone Marrow Transplant. 2007,40:251-259.

23Reiter RA, Varadi K, Turecek PL, et al. Changes in ADAMTS13 (von-Willebrand-factor-cleaving protease) activity after induced release of von Willebrand factor during acute systemic inflammation. Thromb Haemost, 2005,93:554-558.

24Clifford BD, Donahue D, Smith L, et al. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 1995,21:613-619.

25Hsieh MY, Dai CY, Lee LP, et al. Antinuclear antibody is associated with a more advanced fibrosis and lower RNA levels of hepatitis C virus in patients with chronic hepatitis C. J Clin Pathol, 2008,61:333-337.

26Lenzi M, Bellentani S, Saccoccio G, et al. Prevalence of non-organ-specific autoantibodies and chronic liver disease in the general population: a nested case-control study of the Dionysos cohort. Gut, 1999,45:435-441.

27Ono T, Mimuro J, Madoiwa S, et al. Severe secondary deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) in patients with sepsis-induced disseminated intravascular coagulation: its correlation with development of renal failure. Blood, 2006,107:528-534.

28Djamiatun K, van der Ven AJ, de Groot PG, et al. Severe dengue is associated with consumption of von Willebrand factor and its cleaving enzyme ADAMTS-13. PLoS Negl Trop Dis, 2012,6:e1628.

29De Filippis V, Lancellotti S, Maset F, et al. Oxidation of Met1606 in von Willebrand factor is a risk factor for thrombotic and septic complications in chronic renal failure. Biochem J, 2012,442:423-432.

(本文編輯：張苗)

(收稿日期：2015-09-05)

通信作者：張晶，Email：drzhangjing@163.com

基金項(xiàng)目：基于數(shù)據(jù)挖掘的重型肝炎預(yù)后判斷治療決策網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)研究(No. KM2013100250 08)；基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的重型肝炎肝衰竭預(yù)后判斷模型及治療決策網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究(No.CIT&TCD201304178)