關(guān)節(jié)液來源間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展

賈兆鋒 徐曉 劉啟頌 陳潔琳 段莉 朱偉民 熊建義 王大平

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關(guān)節(jié)液來源間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展

賈兆鋒 徐曉 劉啟頌 陳潔琳 段莉 朱偉民 熊建義 王大平

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員,起源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞治療組織損傷。多種類型的成人結(jié)締組織與器官間質(zhì)可分離提取出MSC。研究證實(shí)，關(guān)節(jié)液(SF)也可分離出MSC。相比于其他組織來源的MSC，SF來源MSC(SF-MSC)具有更強(qiáng)的成軟骨細(xì)胞分化能力，在軟骨組織工程方面的應(yīng)用前景廣闊。該文就SF-MSC研究進(jìn)展作一綜述。

間充質(zhì)干細(xì)胞；關(guān)節(jié)液；軟骨組織工程

關(guān)節(jié)軟骨損傷常繼發(fā)于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷或骨關(guān)節(jié)炎(OA)[1]，是臨床治療的難點(diǎn)，其原因是關(guān)節(jié)軟骨自身無血供且再生能力差[2]。因此，學(xué)者們試圖尋找可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生并保持其結(jié)構(gòu)完整性的最佳方法。近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療關(guān)節(jié)軟骨損傷帶來新希望，而間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)作為組織工程重要的種子細(xì)胞一直是研究熱點(diǎn)，其擁有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，尤其在成軟骨細(xì)胞分化方面具有優(yōu)勢，為軟骨損傷修復(fù)組織工程提供了新思路[3-4]。

MSC可從各種類型成人結(jié)締組織與器官間質(zhì)如臍帶、臍血、骨髓、滑膜、骨骼肌和脂肪組織等中分離提取[5-7]。針對不同組織來源MSC的研究證實(shí)，關(guān)節(jié)液(SF)可分離并提取MSC(關(guān)節(jié)液來源MSC，SF-MSC)，有望為關(guān)節(jié)軟骨損傷治療提供新策略[8]。

1 SF與SF-MSC

SF由滑膜內(nèi)膜層細(xì)胞分泌，具有粘性，為不含顆粒物質(zhì)的淡黃色透明液體。正常SF是血漿滲透液、滑膜組織和周圍組織分解代謝產(chǎn)物的綜合，如蛋白多糖和膠原分解的產(chǎn)物[9]。SF營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨，含有生長因子、促炎因子和抗炎因子[10]，可減少軟骨之間的摩擦，起到界面潤滑劑的作用[11]。

Jones 等[12]首次證實(shí)膝關(guān)節(jié)OA患者SF中可提取出SF-MSC。進(jìn)一步研究[13]發(fā)現(xiàn)，SF-MSC水平在OA早期就開始顯著上升，與未發(fā)病時(shí)相比增加7倍。在OA病理?xiàng)l件下，SF可誘發(fā)MSC從滑膜組織或其他組織遷移到SF中，從而使SF中MSC水平急劇升高[14]。

2 SF-MSC分離及培養(yǎng)

與其他來源MSC相比，SF取材容易，關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)穿刺操作不會(huì)損傷其他正常組織，且所需樣本量少[15]。Morito等[16]在關(guān)節(jié)鏡手術(shù)前，將生理鹽水15 mL注入OA患者膝關(guān)節(jié)腔，反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)后用無菌注射器抽取SF沖洗液。Kim等[17]行踝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)前，于踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5 mL生理鹽水，反復(fù)活動(dòng)踝關(guān)節(jié)后抽取踝關(guān)節(jié)SF。

采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離提取SF-MSC，取得SF標(biāo)本4 h內(nèi)用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，使用過濾器過濾，常溫離心后棄上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到相應(yīng)培養(yǎng)皿，使用改良培養(yǎng)基置于溫箱培養(yǎng)，12～24 h 換液，除去未貼壁細(xì)胞，單層平板培養(yǎng)下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)，選擇合適細(xì)胞克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，此為原代SF-MSC。待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)，根據(jù)所獲細(xì)胞量的多少傳代接種，常取P3代細(xì)胞為目的細(xì)胞。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)和高糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)可最大限度地維持MSC處于未分化狀態(tài)及增殖期良好的生長特性，其培養(yǎng)SF-MSC效果最佳。

3 SF-MSC鑒定

3.1 細(xì)胞形態(tài)

原代SF-MSC呈星形或多角形，部分可有偽足，擴(kuò)增培養(yǎng)后，隨著細(xì)胞密度的增加，P1代細(xì)胞可呈短梭形、長梭形或圓形。傳代后，細(xì)胞匯合長滿培養(yǎng)皿，形態(tài)相對均勻，呈類似旋渦狀或向日葵樣[20]。

3.2 免疫表型特征

Friedenstein等[21]最早指出，成纖維細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)可識(shí)別擴(kuò)增形成后貼壁的梭形克隆細(xì)胞，故可作為MSC的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)下屬間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)(MTSCC)提出人MSC的統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)[22]：首先，MSC在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須貼壁生長；其次，MSC必須表達(dá)CD90、CD44、CD105、CD73，不表達(dá)CD34、CD133、CD45、CD79α或CD19、CD14、CD11b、人類白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)；最后，MSC必須具有多向分化潛能。

4 SF-MSC三系分化

4.1 成骨細(xì)胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105/cm2接種于6孔板中，待細(xì)胞亞融合后，加入成骨分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(內(nèi)含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL、地塞米松1 nmol/L、β-甘油磷酸鈉20 mmol/L、維生素C 50 mg/L)開始誘導(dǎo)。觀察細(xì)胞形態(tài)動(dòng)態(tài)變化可見，誘導(dǎo)3 d后細(xì)胞逐漸由梭形向三角形或多角形、方形或鱗片形轉(zhuǎn)變；8 d時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)分泌開始增多，可見細(xì)小黑色顆粒分布于細(xì)胞質(zhì)中及細(xì)胞質(zhì)外，細(xì)胞質(zhì)顏色變深，而細(xì)胞核顏色變淡；3周時(shí)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞大量聚集，形成類似鈣結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，局部可出現(xiàn)疊片狀；4周時(shí)培養(yǎng)皿局部因大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積而呈棕黑色，成骨特異性堿性磷酸酶(ALP)染色可見細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕黑色顆粒沉淀，茜素紅染色可見紅色沉淀物，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測顯示Runx2、骨鈣蛋白表達(dá)明顯增高，完全符合成骨細(xì)胞特征[23]。

SF-MSC雖可誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞，但成骨能力不及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)。Isobe等[7]通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測骨髓、SF、牙髓等來源MSC成骨分化誘導(dǎo)后骨鈣蛋白mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)BMSC成骨分化誘導(dǎo)后骨鈣蛋白mRNA表達(dá)量最高，成骨分化能力最強(qiáng)。

4.2 成脂肪細(xì)胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105/cm2接種于6孔板中，待細(xì)胞亞融合后，加入成脂分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)液(內(nèi)含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL、谷氨酰0.5 μmol/L、胰島素0.5 μmol/L、異丁基甲基黃嘌呤0.5 μmol/L、吲哚美辛0.5 μmol/L、地塞米松0.5 μmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)；觀察細(xì)胞分化過程形態(tài)變化可見，誘導(dǎo)3～5 d時(shí)細(xì)胞逐漸由長梭形向短梭形轉(zhuǎn)變；2周時(shí)細(xì)胞開始變?yōu)閳A形或橢圓形；3周時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈環(huán)狀排列的脂滴形成，油紅O染色呈強(qiáng)陽性，qPCR檢測顯示成脂特異性基因LPL、FABP4、PPARγ2表達(dá)增強(qiáng)，證實(shí)SF-MSC向脂肪細(xì)胞分化[17]。Ogata等[24]比較成脂分化后細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)相比骨髓、滑膜、SF等來源的MSC，脂肪來源MSC可優(yōu)先向脂肪細(xì)胞分化且擁有最強(qiáng)的成脂分化能力,但成骨、成軟骨分化能力較弱。

4.3 成軟骨細(xì)胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105個(gè)接種于6孔板中，置于 37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后，加入軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(內(nèi)含轉(zhuǎn)化生長因子-β3 10 ng/mL、纖維生長因子-2 2 ng/mL、維甲酸1 nmol/L、維生素C磷酸酯50 μg/mL、脯氨酸40 μg/mL、丙酮酸100 μg/mL、地塞米松100 nmol/L、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒預(yù)混合液50 mg/mL)中培養(yǎng)[25]。誘導(dǎo)1周時(shí)檢測出Ⅱ型膠原陽性表達(dá)，并隨時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)；2周時(shí)細(xì)胞逐漸由短梭形變?yōu)槎噙呅?，形態(tài)接近透明軟骨細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程的持續(xù)，多邊形細(xì)胞體積增大；3周后細(xì)胞完全類似透明軟骨形態(tài)，甲苯胺藍(lán)染色顯示有軟骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖(GAG)成分，Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)顯著增高，Ⅰ型膠原mRNA不表達(dá)，表明可形成穩(wěn)定的透明軟骨細(xì)胞[26]。

研究[27]表明，SF-MSC不同于BMSC，它可形成富含軟骨分化潛力大的克隆細(xì)胞集落。Yoshimura等[28]比較不同組織(骨膜、骨髓、滑膜、脂肪及肌肉等)來源MSC的增殖及成軟骨分化潛能，發(fā)現(xiàn)滑膜來源MSC可產(chǎn)生較多的軟骨基質(zhì)并有較強(qiáng)的成軟骨細(xì)胞分化能力。 Fulber等[29]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SF-MSC產(chǎn)生軟骨細(xì)胞外基質(zhì)較滑膜來源MSC多，它有更好的成軟骨分化性能，更易形成透明軟骨細(xì)胞。

5 SF-MSC應(yīng)用

5.1 安全性

Fulber等[29]通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SF-MSC無致瘤性，并指出馬滑膜來源MSC和SF-MSC是安全的。SF在MSC表型特征表達(dá)和細(xì)胞分化過程中均無致瘤性，且利于軟骨細(xì)胞分化。此外，使用自體SF-MSC移植治療可避免免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)方面的爭議。

5.2 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞、細(xì)胞因子、支架材料是軟骨組織工程的基本要素[30]，選擇合適細(xì)胞因子作用于MSC并復(fù)合支架材料來修復(fù)軟骨損傷是目前研究的熱點(diǎn)，如何優(yōu)化誘導(dǎo)條件、得到優(yōu)質(zhì)的組織工程化透明軟骨是目前研究的方向[20]。

Chiang等[31]將豬SF-MSC與含富血小板血漿(PRP)的溫敏水凝膠復(fù)合，體外培養(yǎng)3周，分別在1、7、14、21 d檢測Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，將上述復(fù)合物置入豬股骨髁軟骨缺損處，分別于4、8周取材，經(jīng)大體觀察及組織學(xué)染色證實(shí)，含SF-MSC的水凝膠修復(fù)效果佳，4周時(shí)缺損處大部分被透明軟骨樣組織覆蓋，8周時(shí)缺損區(qū)已完全修復(fù)；推測在體內(nèi)生理環(huán)境下，復(fù)合材料中的SF-MSC可被誘導(dǎo)形成功能性透明軟骨細(xì)胞。

SF-MSC定向成軟骨細(xì)胞分化應(yīng)用于軟骨損傷修復(fù)再生方面的優(yōu)勢明顯，可提高軟骨生物力學(xué)性能。此外，SF-MSC定向成軟骨細(xì)胞分化過程可表達(dá)多種透明軟骨細(xì)胞樣特異性標(biāo)記，并可誘導(dǎo)形成穩(wěn)定的透明軟骨樣組織[32]。

盡管有大量的SF-MSC體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，但目前SF-MSC的體內(nèi)應(yīng)用研究很少且尚無人SF-MSC臨床應(yīng)用的報(bào)道，可能與SF-MSC在機(jī)體中發(fā)揮的具體作用機(jī)制不明有關(guān)。

6 存在問題

6.1 確切組織來源

SF-MSC的確切組織來源尚無定論。Jones 等[12]研究認(rèn)為，SF-MSC可能來源于分解脫落的軟骨、骨、滑膜、骨膜、骨髓等組織。Morito等[16]研究認(rèn)為，膝關(guān)節(jié)SF-MSC可能來源于滑膜組織，原因?yàn)橄啾扔贐MSC，SF-MSC形態(tài)、基因表達(dá)譜及細(xì)胞集落大小均與滑膜來源MSC類似。Sun等[33]研究認(rèn)為，顳下頜關(guān)節(jié)脫落的內(nèi)膜組織是顳下頜關(guān)節(jié)SF-MSC最可能的來源。

6.2 特異性標(biāo)志物

Kolf等[34]研究認(rèn)為，共同表達(dá)STRO-1、CD73和CD106是鑒別MSC最有效的表面標(biāo)記物組合。Krawetz等[35]研究證實(shí)，健康人群或OA患者SF-MSC陽性表達(dá)CD105、CD73和CD44，陰性表達(dá)CD45RO、CD11和CD34；CD90+細(xì)胞比CD90-細(xì)胞有更強(qiáng)的成軟骨細(xì)胞分化潛能，CD90受體與整合素、酪氨酸激酶、生長因子等有關(guān)，可促進(jìn)下游細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞黏附、凋亡、增殖、遷移等。Nagase等[18]研究認(rèn)為，體外培養(yǎng)SF-MSC 7 d，40%～60%的細(xì)胞表達(dá)CD90，但隨后表達(dá)逐漸降低，成軟骨細(xì)胞分化潛能也隨之下降，表明CD90可能影響SF-MSC成軟骨細(xì)胞分化。

BMSC可表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，單一的神經(jīng)節(jié)苷脂GD2表面標(biāo)志物有助于從骨髓周圍組織中區(qū)分出BMSC[36]。來自內(nèi)臟或皮下的脂肪源性MSC因來源部位不同，也可有不同特點(diǎn)。研究[37]表明，表達(dá)CD10細(xì)胞表面標(biāo)記物的MSC為皮下脂肪來源MSC，而表達(dá)CD200細(xì)胞表面標(biāo)記物的MSC則為內(nèi)臟脂肪來源MSC。然而，目前SF-MSC的特異性標(biāo)志物尚無定論，其鑒定還需綜合多種指標(biāo)[15]。

6.3 建立體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的穩(wěn)定體系

體外培養(yǎng)及擴(kuò)增過程中，SF-MSC也會(huì)出現(xiàn)衰老和凋亡。細(xì)胞肥大化在體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中依然嚴(yán)重。Zheng等[38]研究報(bào)道，SF-MSC在體外培養(yǎng)時(shí)，其增殖能力和多向分化潛能隨培養(yǎng)時(shí)間的推移而逐漸降低。

Henrionnet等[39]、Madry等[40]研究認(rèn)為，在不考慮細(xì)胞原始來源的情況下，維持成軟骨細(xì)胞表型特征或促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化的重要因素為生長或可溶性因子、機(jī)械負(fù)荷、環(huán)境因素(如缺氧刺激)。MSC向軟骨細(xì)胞分化過程中，聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β等可有效維持軟骨細(xì)胞表型與提高轉(zhuǎn)化效率[41]。靜水壓是體內(nèi)關(guān)節(jié)環(huán)境的重要組成部分，它與MSC成軟骨分化能力密切相關(guān)[42]。低氧條件下(3%O2)分離和擴(kuò)增MSC可增強(qiáng)其形成穩(wěn)定軟骨細(xì)胞的能力且可能是控制細(xì)胞肥大化的潛在工具[43]。值得注意的是，目前大多數(shù)研究都限于1種或結(jié)合2種上述因素，尚缺乏將3種因素結(jié)合的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。如何維持SF-MSC高效的分化狀態(tài)及穩(wěn)定的細(xì)胞表型是亟待解決的問題。

7 結(jié)語

SF-MSC較易從SF中分離和培養(yǎng)，來源廣泛，并能迅速大量擴(kuò)增，自我更新能力強(qiáng)，擁有多種分化潛能，特別是成軟骨細(xì)胞分化能力突出，可作為軟骨再生組織工程理想的種子細(xì)胞來源。但目前對于SF-MSC的研究尚處于起步階段，很多問題尚未解決，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。盡管如此，隨著對SF-MSC研究的不斷深入，相信其將在構(gòu)建組織工程化軟骨及臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。

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(收稿：2016-07-27；修回：2016-09-05)

(本文編輯：李圓圓)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572198)、廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313772)、深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)基礎(chǔ)研究布局項(xiàng)目(JCYJ20160301111338144)、深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(JSGG20140519105550503)

510182， 廣州醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院(賈兆鋒)；518035， 深圳市運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)技術(shù)工程研究中心(賈兆鋒、徐曉、劉啟頌、陳潔琳、段莉、朱偉民、熊建義、王大平)；518035， 深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(賈兆鋒、徐曉、劉啟頌、陳潔琳、段莉、朱偉民、熊建義、王大平)

王大平 E-mail: dapingwang1963@qq.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.008