熱休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用

洪育蒲 綜述 王衛(wèi)星 審校

(武漢大學人民醫(yī)院普外科，湖北 武漢 430060)

·綜 述·

熱休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用

洪育蒲 綜述 王衛(wèi)星 審校

(武漢大學人民醫(yī)院普外科，湖北 武漢 430060)

熱休克蛋白(HSPs)是廣泛存在于生物體內的高度保守的一類應激蛋白。HSP對各種刺激具有迅速的反應能力，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡以及分子伴侶等作用，在細胞的生長發(fā)育、代謝分化、基因轉錄、維持組織細胞的自穩(wěn)和環(huán)境適應性方面扮演著重要角色。而其中最受研究者關注的是HSP70，其在生理狀態(tài)下少量表達，可通過熱預處理、藥物以及基因轉染等方法誘導其產生，從而發(fā)揮細胞保護作用。本文就HSP70在急性胰腺炎中的作用以及相關機理的研究進展做一綜述。

熱休克蛋白；急性胰腺炎；機理

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是多種病因引起的胰腺內消化酶激活，導致胰腺組織自身消化的局部炎癥反應，病情較重者可進展為全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，并可伴有其他器官功能改變，甚至發(fā)生多器官功能障礙綜合征(MODS)，是常見的急腹癥。

熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)廣泛存在于人、動物、植物和微生物細胞中，是一類具有重要的生理功能和結構上高度保守的多肽類蛋白質分子家族[1]。HSP在蛋白質的合成、折疊、凝集、轉運和降解起到重要的分子伴侶作用，在維持細胞的自穩(wěn)和環(huán)境適應性等方面扮演著重要角色。機體遭受組織損傷、缺血、缺氧、病原微生物感染、炎癥等均可引起細胞的應激反應，從而誘導HSP的表達，以維持細胞的正常生理功能，故又稱應激蛋白[2]。其中HSP70是HSP家族中的重要成員，目前已知其結構上最為保守，在大多數(shù)生物細胞中含量最多，且在機體應激反應中最為敏感。近年來一系列研究發(fā)現(xiàn)，HSP70具有能保護細胞免受刺激損傷，促進受損細胞自身進行修復以及抗炎等作用，在急性胰腺炎保護中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)就HSP70在急性胰腺炎中的保護作用的研究進展予以綜述。

1 HSP70概述

1.1 HSP70的分類及結構 HSP70家族主要包含4類蛋白質[3]：(1)誘導型HSP70，又稱HSP72，存在于細胞核，在正常細胞內表達較少，其表達在細胞受到應激原刺激后迅速增加，HSP70.1是編碼它的主要基因之一；(2)結構型HSP70，即HSC70(Heat shock cognate protein 70)又稱HSP73，存在于胞漿，是在哺乳動物所有細胞內均能表達的結構蛋白，發(fā)生應激后僅有少量增加；(3)葡萄糖調節(jié)蛋白75(Glucose regulated protein 75，GRP75)，是位于線粒體內的分子伴侶，參與調控線粒體穩(wěn)態(tài)和致癌作用，又稱為死亡蛋白(Mortalin)[4]；(4)葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)，是位于內質網(wǎng)的伴侶蛋白，參與調控鈣穩(wěn)態(tài)與細胞凋亡，又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)。其中，HSP72和HSP73具有高度的序列同源性和相似的生物化學特性。

HSP70蛋白的一級結構可分為3個功能域[5]：近N端為高度保守的氨基酸序列，分子量約44 kDa，為核苷酸結合域(Nucleotide biding domain，NBD)，具有ATP酶活性，其保守性比羧基端更高，與不同生物的HSP70所共有的生化特性有關；緊接著為保守的氨基酸序列，分子量約16 kDa，為多肽結合功能域(Polypeptide biding domain，PBD)；近C端包含有結構不明確的氨基酸序列，分子量約10 kDa，參與特定的蛋白底物相互作用。

1.2 HSP70的生物學特性及合成 HSP70家族具有以下生物學特性：(1)所有HSP70的ATP親和性較高，ATP酶活性較弱，NBD與ATP結合后發(fā)生構象改變促使蛋白底物與PBD解離，ATP-HSP70對靶蛋白的親和性更高，形成HSP70蛋白復合體后穩(wěn)定結合[6]；(2)其他HSP或細胞因子對HSP70蛋白復合體的形成起到輔助作用[7]；(3)在蛋白穩(wěn)定構象的形成、運輸或降解過程中，HSP70需選擇性結合某些多肽或特殊蛋白；(4)HSP70家族具有結構上高度保守的鈣調素結合域，保護靶蛋白不被降解[8]。

HSP70的合成主要受熱休克轉錄因子(Heat shock transcription factor 1，HSF1)的調控。在無應激狀態(tài)下，HSF1以單體形式與HSP70結合形成復合物而使得活性受到抑制。當細胞受到刺激，細胞內的變性蛋白增加時，HSF1單體從復合物上解離形成三聚體使得HSF1能夠轉位到核內，在核內HSF1通過其絲氨酸殘基的磷酸化結合到HSP基因上的啟動子熱休克元件上，從而激活HSP的轉錄及后續(xù)的翻譯過程[9-10]。

2 HSP70在急性胰腺炎中的作用

Frossard等[11]研究表明用電熱墊將大鼠體溫升高至42℃維持20 min，可以誘導胰腺內HSP70表達增加，防止超大劑量蛙皮素引起的胰腺腺泡損傷，阻止胰蛋白酶原活化與胰蛋白酶激活肽(TAP)產生。此外，HSP70在精氨酸和牛磺膽酸鈉誘導的急性胰腺炎動物模型中也有保護作用[12-13]。

Bhagat等[14]應用HSP70反義引物注射到大鼠體內，熱應激誘導的HSP70表達受到抑制，超大劑量蛙皮素刺激得以恢復激活胰腺內胰蛋白酶原的能力，淀粉酶(AMY)和TAP水平升高，使得熱應激預處理失去保護作用，同時在未經(jīng)熱應激預處理的大鼠中，HSP70反義引物加劇了胰腺炎的嚴重程度。并且進一步以熱休克因子-1(HSF-1)敲除和HSP70過表達轉基因小鼠來證明HSP70的保護作用[15]，HSF-1敲除小鼠胰腺炎程度較野生型小鼠嚴重，HSP70過表達轉基因小鼠胰腺炎得到緩解。Hwang等[16]報道，在蛙皮素注射前，HSP70.1基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，前者胰蛋白酶基礎活性、酶原與溶酶體的組織蛋白酶B比例均增高，進而可自發(fā)性發(fā)生胰蛋白酶原激活。由亞砷酸鈉誘導的HSP70在大鼠胰腺內高效表達，緩解了蛙皮素和精氨酸誘發(fā)的急性胰腺炎損傷[17]。Meng等[18]用 42℃生理鹽水腹腔灌洗30 min作為熱應激誘導HSP70在胰腺內高表達，明顯降低血清AMY、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及TAP水平，使得胰腺組織損傷減輕。

3 HSP70在急性胰腺炎中的作用機理

目前，大量研究支持HSP70在胰腺炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的保護作用，但是具體機理尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究認為HSP70主要通過以下兩種機理發(fā)揮胰腺保護作用。

3.1 抑制溶酶體酶和消化酶原的共區(qū)域化 在正常條件下，消化酶原和溶酶體水解酶均在腺泡細胞粗面內質網(wǎng)合成，分別經(jīng)高爾基體各自形成分泌泡并轉運至相應的消化酶原顆粒和溶酶體中。Steer等[19]首次發(fā)現(xiàn)在胰腺炎中，胰腺內的消化酶和溶酶體水解酶發(fā)生轉運障礙。兩種酶同時出現(xiàn)在細胞內的吞噬囊泡中，當囊泡破裂時，活化的胰酶釋放，造成胰腺自我消化和胰腺炎的發(fā)生。有研究表明，HSP70可以阻止溶酶體組織蛋白酶B和消化酶原的共區(qū)域化，削弱腺泡細胞的酶原活化，減輕胰腺炎程度[16]。此前，Rakonczay等[20]報道熱應激預處理誘導的HSP70表達，不能對胰腺內直接注射胰蛋白酶誘導的壞死性胰腺炎發(fā)揮保護作用，提示HSP一定程度上是通過阻礙胰酶活化而使胰腺炎緩解。

有研究者在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，縮膽囊素誘導的溶酶體組織蛋白酶B再分布和酶原活化依賴于鈣離子濃度的病理性上升，螯合細胞內的鈣離子可阻止共區(qū)域化的發(fā)生[21-22]。這提示HSP70可能通過調節(jié)細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)，干擾引起酶原活化和胰腺炎發(fā)生的細胞內蛋白轉運過程。

胰蛋白酶原的活化還與自噬的發(fā)生有關[23-26]。LC3B-Ⅱ是自噬小體的通用標記物，自噬發(fā)生時，LC3B-Ⅱ的表達與自噬小泡水平的增加相對應[27]。HSP70水平的升高可以顯著抑制胰腺炎大鼠LC3B-Ⅱ的表達，并減少胰腺腺泡細胞自噬小體和自噬溶酶體的生成[28]。進一步研究表明，HSP70可通過Akt-mTOR途徑發(fā)揮對自噬的抑制作用，HSF1表達減少使得自噬的基礎水平增加。HSP70活化蛋白激酶Akt，使得mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白)發(fā)生磷酸化，磷酸化的mTOR與銜接蛋白RAPTOR結合形成復合體mTORC1[29]。mTORC1不僅可以抑制自噬的表達，還參與了HSF1的活化，進而促進HSP70的表達[30]，降低了胰蛋白酶活性而減輕胰腺炎損傷程度。

3.2 下調NF-κB，限制炎癥介質產生 NF-κB是一種多功能核轉錄因子，可以通過調節(jié)許多炎癥因子(TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8)來作用于炎癥反應，而這些炎癥因子又可以反過來激活NF-κB，形成一個正反饋。在靜息細胞中，NF-κB與抑制因子IκBα結合形成無活性的復合體而存在于胞漿中，當細胞受外來刺激時，IκBα被IκB激酶(IKK)磷酸化，繼而經(jīng)泛素化途徑降解，使得NF-κB的核轉位信號暴露并移位至細胞核內與親和力高的DNA序列結合，激活下游靶基因的轉錄[31]。由于IκBα基因的轉錄啟動區(qū)包含3個NF-κB結合位點，在NF-κB激活的同時，IκBα也被誘導而大量表達，并與NF-κB結合，從而終止NF-κB活化，這構成了NF-κB激活的負反饋途徑[32]。

Altavilla等[33]研究表明，在急性胰腺炎早期階段，胰腺釋放的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等炎癥介質的異常反應不僅造成胰腺局部損傷，還會引起一系列“瀑布式”級聯(lián)效應，甚至發(fā)生SIRS和MODS[34]。Long等[35]報道，NF-κB在胰腺炎發(fā)生時迅速被激活，在NF-κB基因敲除小鼠胰腺炎模型中，胰腺炎嚴重程度顯著降低。Baumann等[36]在IKK2組成激活與IKK2顯性失活的轉基因小鼠中應用蛙皮素誘導急性胰腺炎，發(fā)現(xiàn)IKK2顯性失活的小鼠胰腺局部炎癥較野生型小鼠明顯減輕，IKK2組成激活的胰腺炎小鼠的TNF-α、IL-1及ICAM-1水平較野生型小鼠明顯升高，但蛙皮素誘導的離體腺泡內胰酶活化在兩組轉基因小鼠之間沒有顯著差異。Ji等[37]在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)細胞內活化的胰蛋白酶不能激活NF-κB及其下游炎癥介質的釋放，而外源性胰蛋白酶可顯著增強腺泡細胞的NF-κB活性。以上研究提示腺泡細胞內胰蛋白酶原活化與NF-κB激活在胰腺損傷時可能是兩個相對獨立的過程。此外，F(xiàn)rossard等[38]發(fā)現(xiàn)HSP70在高熱預處理的胰腺細胞中高表達，與此同時NF-κB活化延遲。Zhu等[39]研究表明，42℃生理鹽水連續(xù)腹腔灌洗可以誘導大鼠胰腺表達HSP70增加，降低血清TNF-α及IL-8水平。轉基因小鼠過表達HSP72可以通過減弱NF-κB通路信號，加快胰腺組織損傷修復[40]。因此，一些研究者認為HSP70可能通過下調NF-κB活性來限制炎癥因子的產生，減少了炎癥因子對NF-κB的正反饋激活，進而減輕胰腺炎病情。

HSP主要通過以下途徑抑制NF-κB的活性：首先，熱休克反應可以降低IκB/NF-κB通路上游的NF-κB誘導激酶、IL-1受體相關激酶的溶解性，進而抑制IKK的激活，并增加細胞內磷酸酶的活性，進而降低IκBα的磷酸化水平，抑制IκBα的降解[41]。其次，IκBα的啟動子內含有熱休克元件，使得IκBα基因的轉錄與HSP基因同時進行，且熱休克反應在后轉錄水平也促進IκBα基因的表達[42]。此外，HSP可競爭性抑制NF-κB經(jīng)核孔復合體進入細胞核內[43]。HSP70亦可促進核內NF-κB亞單位p65蛋白的降解來抑制NF-κB促炎信號[44]，阻礙胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。

4 結 語

綜上所述，HSP70作為一種重要的細胞保護因子，其表達增加可抑制胰蛋白酶原活化與限制炎癥級聯(lián)反應，減少胰腺腺泡壞死及全身炎癥反應的發(fā)生，從而緩解急性胰腺炎的病情進展。

目前關于HSP70在急性胰腺炎及其他炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用的研究大多集中在離體細胞和動物實驗中，在人體上的研究很少。HSP70在急性胰腺炎的作用機制仍有待進一步闡明，為開發(fā)應用非毒性藥物或基因工程等手段誘導HSP70表達發(fā)揮臟器保護作用提供新的途徑。

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Research progress of heat shock protein 70 in acute pancreatitis.

HONG Yu-pu,WANG Wei-xing.Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

Heat shock proteins(HSPs)are a highly conserved group of stress proteins which exist in virtually all known organisms.HSPs possess rapid reactive potency to all kinds of stimulus,and have effects on anti-inflammation,anti-oxidation,anti-apoptosis,as well as molecular chaperones.These proteins play an essential role in a variety of cellular activities including cell growth and development,metabolism and differentiation,gene transcription,intracellular homeostasis and environmental adaptability.HSP70 is attracting the most attention among HSPs,which express at a lower degree in physiological condition than induced by prior thermal stress,drug,gene transfection,and consequently exert cytoprotection.Research progresses of HSP70 about its effects and related mechanisms in acute pancreatitis were reviewed in this article.

Heat shock proteins;Acute pancreatitis;Mechanism

R657.5+1

A

1003—6350（2016）11—1823—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.033

2015-11-16)

國家自然科學基金(編號：81370562、81300356)

王衛(wèi)星。E-mail：sate.llite@163.com