卵母細(xì)胞玻璃化凍融獲成功妊娠1例

唐永梅 韋立紅

(廣西柳州市婦幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

卵母細(xì)胞玻璃化凍融獲成功妊娠1例

唐永梅 韋立紅

(廣西柳州市婦幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

目的 探討玻璃化冷凍方法在冷凍保存卵母細(xì)胞中的臨床應(yīng)用價值。方法 2015年3月在我中心行卵母細(xì)胞玻璃化冷凍1例,于2015年7月行玻璃化解凍，行卵胞漿內(nèi)單精子注射受精，獲得胚胎后進行移植和冷凍。結(jié)果 共冷凍13枚卵母細(xì)胞，解凍后存活12枚(92.3%)，對12枚成熟卵母細(xì)胞行單精子卵漿內(nèi)顯微注射，9枚(75.0%)正常受精，8枚(88.9%)卵裂，再次解凍移植獲單胎妊娠，現(xiàn)正在妊娠中。結(jié)論 玻璃化凍融卵母細(xì)胞是一種方便可行的方法,在特殊情況下發(fā)揮著不可替代的作用，可以獲得臨床妊娠。

體外受精胚胎移植；卵母細(xì)胞；玻璃化冷凍

卵母細(xì)胞是人類最大的單細(xì)胞，對外部環(huán)境非常敏感。卵母細(xì)胞在冷凍過程中很少能完好無損。因為減數(shù)分裂的紡錘體對溫度敏感且冷凍后透明帶變硬，所以通常采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射解決卵子受精。玻璃化冷凍技術(shù)可以解決卵子低存活率問題，使冷凍卵母細(xì)胞的效率大大提高。現(xiàn)報道我中心采用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍的1例成功案例。

1 病例摘要

樊某，36歲，因輸卵管因素，原發(fā)不孕6年于2015年3月在我中心行體外受精胚胎移植術(shù)治療?；颊呋A(chǔ)激素：孕酮(progesterone，P)0.51 ng/ml，雄性激素(testosterone，T)68.82 ng/dl，雌二醇(estradiol，E2)101.31 pg/ml，垂體泌乳素(prolactin，PRL)6.89 ng/ml，促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)7.89 MIU/ml，促黃體素(luteotropic hormone，LH)5.52 MIU/ml，基礎(chǔ)竇卵泡14個，采用注射用醋酸曲普瑞林(達(dá)菲林，益普生制藥有限公司)1.2 mg長方案降調(diào)節(jié)22 d后給予人促性腺激素(Gn)150 IU/d，連用12 d。當(dāng)卵泡直徑大于18 mm的卵泡數(shù)為8個，占發(fā)育卵泡60%時，注射重組人絨促性素(艾澤，默克雪蘭諾公司)250 μg 36 h后，陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，穿刺18個卵泡獲得17個卵子。由于取卵日患者丈夫因車禍在治療中不能來院取精，患者要求冷凍卵母細(xì)胞并簽署知情同意書。故在取卵后2 h給予透明質(zhì)酸酶80 IU消化20～30 s后脫顆粒細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察有13個成熟卵(MⅡ期)，4個未成熟卵(GV期)。對13個MⅡ期卵行玻璃化冷凍，1～2個/管共7管，冷凍試劑盒采用Irvine公司通用玻璃化冷凍試劑盒。2015年7月，夫婦倆來院申請解凍卵母細(xì)胞后行體外受精胚胎移植術(shù)治療。女方采用促排卵周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 000 IU 36 h后解凍卵母細(xì)胞，解凍13個卵母細(xì)胞，存活12個，同時囑男方取精，處理后行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后正常受精9個，卵裂8個，可利用胚胎6個，其中優(yōu)胚4個。于受精后72 h(D3)移植2枚胚胎，冷凍4枚。移植日內(nèi)膜厚度12 mm，移植后肌注黃體酮60 mg/d，14 d后檢測血HCG陰性，未妊娠。2015年8月患者再次來院申請解凍移植，采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，移植日內(nèi)膜厚度11 mm，解凍移植2枚優(yōu)胚后常規(guī)肌注黃體酮60 mg/d，14 d后血HCG陽性，35 d后 B超顯示宮內(nèi)單胎妊娠，至2015年11月繼續(xù)妊娠中。

2 討 論

1986年Chen等[1]應(yīng)用程序冷凍技術(shù)成功冷凍、復(fù)蘇了人卵母細(xì)胞并獲嬰兒出生，但采用傳統(tǒng)冷凍保護劑PROH和蔗糖的程序冷凍技術(shù)的復(fù)蘇存活率和受精率低。1999年Kuleshova等[2]應(yīng)用玻璃化冷凍法成功冷凍、復(fù)蘇卵母細(xì)胞并獲分娩以后，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的效率大大提高。卵母細(xì)胞體積大(80～130 μm)，在冷凍過程中滲透性冷凍保護劑進入細(xì)胞膜和水分滲透出細(xì)胞膜的速度均明顯較慢，容易形成細(xì)胞內(nèi)冰晶，另外卵母細(xì)胞的一些特殊結(jié)構(gòu)微管、微絲、紡錘體也易受冷凍的影響，冷凍損傷卵母細(xì)胞的骨架，尤其是紡錘體結(jié)構(gòu)進而影響卵母細(xì)胞的生理功能，影響復(fù)蘇存活率和胚胎發(fā)育[3]。目前傳統(tǒng)的程序冷凍技術(shù)逐漸被玻璃化冷凍技術(shù)替代。玻璃化冷凍采用高濃度的低溫保護劑，高滲透性抗凍劑在短時間內(nèi)達(dá)到細(xì)胞內(nèi)、外的濃度平衡，將細(xì)胞內(nèi)大部分水置換，并與剩余水分形成氫鍵，降低凍結(jié)部分電解質(zhì)濃度，使細(xì)胞減輕鹽害及溶液效應(yīng)；同時也改變了胞內(nèi)過冷狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)壓接近細(xì)胞外壓，降低了細(xì)胞脫水皺縮程度和速度，減小了細(xì)胞的損傷，成為目前卵子冷凍方法的主流。

國際上卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)主要用于女性生育力的保存，如有生育要求的未婚女婦女或腫瘤患者在放療和化療前進行卵母細(xì)胞的冷凍保存。在我國該技術(shù)未被廣泛應(yīng)用，目前主要用于供卵周期或取卵日男方取不出精子時[4-6]。當(dāng)然睪丸取精是預(yù)測和干預(yù)取卵日取精失敗的保障，可以避免卵母細(xì)胞的冷凍[7]。筆者對于本例患者獲得成功的體會有以下幾點：(1)使用適合的玻璃化試劑盒，并嚴(yán)格按操作說明操作，卵子冷凍可以得到較好的復(fù)蘇效果。(2)采用Cryotop冷凍載桿，冷凍時減少保護液量，同時每支載桿最多裝載2個卵子，使細(xì)胞迅速度過冷凍解凍的溫度危險區(qū)。(3)卵子的冷凍時機很重要，盡可能在取卵后3 h內(nèi)冷凍，否則卵子老化影響ICSI授精后的卵裂速度。 雖然有報道認(rèn)為冷凍GV期比MⅡ期的解凍存活率更高[8]，但GV期復(fù)蘇行體外成熟再ICSI受精后的發(fā)育潛力較低，故本例未冷凍GV期卵母細(xì)胞，但隨著研究技術(shù)的發(fā)展，冷凍GV期卵母細(xì)胞將會得到更好的應(yīng)用。

卵母細(xì)胞冷凍保存作為生育力保存的重要組成部分，在特殊情況下發(fā)揮著不可替代的作用。作為取卵日男方取精失敗的措施，卵子玻璃化冷凍是減少患者相關(guān)損失的最后保障。目前對卵母細(xì)胞安全性仍有待研究[9-10]。隨著玻璃化冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展和國家法律法規(guī)的不斷完善，該技術(shù)將可廣泛應(yīng)用于臨床。

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唐永梅(1975～)，女，本科，副主任技師，研究方向：輔助生殖實驗室技術(shù)。

R 714.13

B

0253-4304(2016)04-0579-02

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.41

2015-11-30

2016-02-23)