小汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象的觀察

王彬彬　張翠萍　趙志力　付小兵　王 麗（.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院整形美容科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0007；.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 00048；. 北京軍區(qū)總醫(yī)院整形美容中心,北京 00700）

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小汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象的觀察

王彬彬1張翠萍2趙志力3付小兵2王 麗2
（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院整形美容科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3. 北京軍區(qū)總醫(yī)院整形美容中心,北京 100700）

【摘要】目的：觀察小汗腺是否具有自發(fā)熒光現(xiàn)象及其隨汗腺細(xì)胞生長、衰老的變化，推測(cè)其發(fā)光基團(tuán)，探討研究小汗腺的新方法。方法：取整形美容患者棄用的皮膚組織，蘇木素染色，奧林巴斯倒置相差顯微鏡觀察小汗腺組織的自發(fā)熒光現(xiàn)象。從皮膚中提取單個(gè)汗腺細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，于汗腺細(xì)胞貼壁后7、14、21、28 d在奧林巴斯倒置相差顯微鏡分別以紫外光、綠光、藍(lán)光3種不同激發(fā)光照射，觀察小汗腺自發(fā)熒光的變化情況；利用激光掃描共聚焦顯微鏡γ掃描測(cè)量小汗腺自發(fā)熒光的強(qiáng)度。結(jié)果：蘇木素染色后的小汗腺組織自發(fā)熒光表現(xiàn)為似有小孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小汗腺邊界清晰，其自發(fā)熒光在藍(lán)色激發(fā)光下表現(xiàn)為綠色自發(fā)熒光，綠色激發(fā)光下表現(xiàn)出紅色自發(fā)熒光；單獨(dú)的小汗腺細(xì)胞在熒光顯微鏡下表現(xiàn)出更多顏色的自發(fā)熒光，紫外光的激發(fā)下顯示出藍(lán)色的自發(fā)熒光，藍(lán)色的激發(fā)光下顯示出綠色自發(fā)熒光，綠色的激發(fā)光下顯示出紅色的自發(fā)熒光，隨小汗腺的生長，熒光強(qiáng)度沒有明顯變化；用激光掃描共聚焦顯微鏡γ分層掃描方法測(cè)定小汗腺自發(fā)熒光強(qiáng)度，分別在近530 nm和590 nm處發(fā)現(xiàn)兩個(gè)自發(fā)熒光峰值，與黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值相近。結(jié)論：通過觀察蘇木素染色后小汗腺組織的自發(fā)熒光可以簡單、快速地幫助判斷小汗腺結(jié)構(gòu)。單個(gè)汗腺細(xì)胞的自發(fā)熒光強(qiáng)度隨汗腺生長沒有明顯減弱。根據(jù)小汗腺自發(fā)熒光的峰值測(cè)定初步判定小汗腺自發(fā)熒光的發(fā)光基團(tuán)是黃素和脂褐素。

關(guān)鍵詞小汗腺自發(fā)熒光熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡黃素脂褐素

自發(fā)熒光是組織固有的性質(zhì)。皮膚自發(fā)熒光產(chǎn)生的原因在于皮膚組織中存在熒光基團(tuán)，在某些病理變化中皮膚還會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性和外源性的熒光基團(tuán)[1-2]。人體的汗腺分為大汗腺與小汗腺兩種，它們?cè)谡{(diào)節(jié)人體生理活動(dòng)中不可缺少。大汗腺主要分布于腋窩和生殖器部位的真皮深層，不參與體溫調(diào)節(jié)。小汗腺分部在除了唇緣、甲床、乳頭、生殖器外的皮膚組織，主要負(fù)責(zé)分泌汗液調(diào)節(jié)體溫。對(duì)汗腺的深入研究可以提高對(duì)疾病狀態(tài)（如無汗癥或多汗癥）下器官、組織、細(xì)胞和分子影響的認(rèn)識(shí)[3-4]。因此，了解汗腺由不同疾病導(dǎo)致的功能和結(jié)構(gòu)的變化具有重要臨床意義。關(guān)于汗腺的生理病理指標(biāo)以及汗腺損傷后的再生一直是科研難題，汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象也鮮有報(bào)道。我們?cè)?jīng)在離體汗腺細(xì)胞的培養(yǎng)中，觀察到小汗腺在熒光顯微鏡下有自發(fā)熒光現(xiàn)象。本研究中，我們?cè)趭W林巴斯倒置相差顯微鏡下觀察了小汗腺組織自發(fā)熒光的特點(diǎn)及其隨汗腺細(xì)胞生長、成熟、衰老的變化，采用共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)了小汗腺自發(fā)熒光強(qiáng)度，報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器倒置相差顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)（奧林巴斯IX71，日本），顯微鏡自帶3種激發(fā)光：藍(lán)色激發(fā)光(430～500 nm),綠色激發(fā)光(500～560 nm),紫外線激發(fā)光(< 430 nm)。激光掃描共聚焦顯微鏡 (LCSM， Leica-SP8STWS，德國)。自發(fā)熒光淬滅劑C1212（北京普利萊技術(shù)有限公司)。

1.2皮膚組織中小汗腺組織自發(fā)熒光觀察取北京軍區(qū)總醫(yī)院激光整形美容中心患者手術(shù)棄用皮膚組織，包括手部以及腹部皮膚，患者同意并簽署知情同意書。 4例患者中男2例，女2例；年齡23~56歲。手術(shù)過程均嚴(yán)格禁止任何腐蝕性操作以免破壞汗腺組織。將新鮮皮膚組織剪成約1 cm×1 cm×1 cm的皮片，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、 切片（厚5 μm），蘇木素染色，倒置相差顯微鏡下觀察皮膚組織中的小汗腺形態(tài)和其自發(fā)熒光特點(diǎn)。染色后的汗腺組織用蒸餾水沖洗后，放入平皿中，加入覆蓋切片的淬滅劑，室溫下孵育60 min ；吸去淬滅劑，蒸餾水短暫沖洗；吸去蒸餾水，PBS沖洗3次，奧林巴斯倒置相差顯微鏡下觀察熒光是否具有特異性。

1.3分離培養(yǎng)小汗腺組織自發(fā)熒光的觀察取新鮮皮膚組織去掉皮下脂肪層，D-Hanks液浸洗去除血液，剪成約1 mm×1 mm×1 mm的皮粒，放入60 ml培養(yǎng)皿中，加入5 ml（2 mg/ml）Ⅱ型膠原酶，混勻后置于37 ℃、5﹪CO2孵箱中8～12 h，倒置相差顯微鏡下用無菌移液槍。吸取游離的小汗腺細(xì)胞，分別置于普通培養(yǎng)皿以及Confocal皿中，加入配制好的汗腺培養(yǎng)基(在DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加10%的胎牛血清，重組人表皮生長因子10 ng/100 ml,三碘甲狀腺原氨酸2 nmol/ml,半琥珀酰氫化可的松0.4 μg/ml,胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉1 ml/100 ml,青霉素100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml )， 48～72 h后汗腺細(xì)胞貼壁后每3 d更換1次培養(yǎng)基。于細(xì)胞貼壁后7 d，將裝有貼壁汗腺細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于倒置相差顯微鏡載物臺(tái)上，分別以紫外光、藍(lán)光、綠光照射汗腺團(tuán)，觀察小汗腺自發(fā)熒光圖像，每隔7 d拍照，觀察小汗腺自發(fā)熒光隨汗腺細(xì)胞生長的變化情況，觀察至汗腺細(xì)胞貼壁后28 d。

為了選擇最優(yōu)熒光觀測(cè)區(qū)域，需要考慮到衰減可能性和保證適當(dāng)?shù)男盘?hào)噪聲比，首先在顯微鏡下選擇一個(gè)合適的區(qū)域觀察單獨(dú)的小汗腺細(xì)胞，測(cè)定自發(fā)熒光的時(shí)機(jī)選擇在肉眼觀察熒光最明顯時(shí)的激發(fā)光處。

1.4激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描當(dāng)汗腺細(xì)胞貼壁以后，將種植于Confocal皿中的小汗腺細(xì)胞置于載物臺(tái)，調(diào)整合適的視野和肉眼可見熒光最明顯處的光圈大小，激光掃描共聚焦顯微鏡λ模式分層掃描，觀察測(cè)量小汗腺自發(fā)熒光強(qiáng)度。

2　結(jié) 果

2.1汗腺組織自發(fā)熒光特點(diǎn)蘇木素染色后的汗腺組織自發(fā)熒光表現(xiàn)為似有小孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。小汗腺邊界非常清晰,倒置相差顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下綠色熒光和綠色激發(fā)光下紅色熒光清楚,但紫外線下激發(fā)光沒有顯示自發(fā)熒光現(xiàn)象。熒光猝滅劑無法將熒光淬滅，表明汗腺自體熒光無特異性。圖1（見封二）。2.2小汗腺生長過程中自發(fā)熒光變化從皮膚組織中分離出小汗腺進(jìn)行培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下在明敞視野下觀察，并分別以紫外光、藍(lán)光、綠光為激發(fā)光源照射汗腺，可以分別觀察到藍(lán)色、綠色以及紅色的自發(fā)熒光，且各種自發(fā)熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，汗腺團(tuán)結(jié)構(gòu)清晰，可以清晰分辨出汗腺導(dǎo)管部，汗腺導(dǎo)管熒光強(qiáng)度部較其他部位稍強(qiáng)。汗腺細(xì)胞貼壁后7、14、21、28 d，肉眼觀察到汗腺自發(fā)熒光隨汗腺生長及衰老并沒有明顯變化。圖2（見封二）。2.3激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描小汗腺熒光大小在激光掃描共聚焦顯微鏡λ模式分層掃描下，小汗腺表現(xiàn)出綠色自發(fā)熒光時(shí)，500～620 nm激發(fā)光范圍內(nèi)出現(xiàn)了兩個(gè)自發(fā)熒光高峰，隨機(jī)取圖片中的6個(gè)點(diǎn)，根據(jù)其自發(fā)熒光值制圖，發(fā)現(xiàn)峰值出現(xiàn)在近530 nm和590 nm處（圖3,見封二）；在小汗腺表現(xiàn)出紅色自發(fā)熒光時(shí)， 570～700 nm激發(fā)光范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)自發(fā)熒光峰值，隨機(jī)取圖片中的6個(gè)點(diǎn)，根據(jù)其自發(fā)熒光值制圖，其峰值出現(xiàn)在近590 nm處（圖4，見封二）。上述峰值與黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值相近[2]，推測(cè)引起小汗腺自發(fā)熒光的物質(zhì)為黃素和脂褐素。

3　討 論

當(dāng)用一種波長的光照射某種物質(zhì)時(shí)，這種物質(zhì)得到光子，激發(fā)自身產(chǎn)生比照射光波長更長的可見光，這種現(xiàn)象稱為自發(fā)熒光。在醫(yī)學(xué)方面，自發(fā)熒光研究主要集中于視網(wǎng)膜疾病、呼吸系統(tǒng)腫瘤等相關(guān)疾病的病理過程研究、診斷和治療[5-6]。

近年來，醫(yī)學(xué)方面關(guān)于汗腺的研究主要集中在汗腺的再生與修復(fù)基因調(diào)控、相關(guān)蛋白和通道方面[7-12]，而關(guān)于汗腺光學(xué)特點(diǎn)的研究鮮有報(bào)道。組織中的自發(fā)熒光基團(tuán)主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，如膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維中，而這些纖維組織是細(xì)胞構(gòu)架的主要組成部分，我們猜測(cè)這些組織構(gòu)架應(yīng)該可以通過組織的自發(fā)熒光來觀察到[2]，而且，通過研究小汗腺組織自發(fā)熒光圖像來確定小汗腺的結(jié)構(gòu)較光學(xué)顯微鏡觀察簡單、快速。我們的研究清楚地顯示了皮膚組織中小汗腺在不同狀態(tài)下的自發(fā)熒光現(xiàn)象，可以清晰地觀察到綠色和紅色的自發(fā)熒光,并且不會(huì)衰減，不能被熒光淬滅劑淬滅?？梢?這種自發(fā)熒光具有非特異性[1-2]。

我們觀察到，離體的汗腺細(xì)胞顯示了不同顏色的自發(fā)熒光，而且隨汗腺的生長、成熟和老化，熒光并沒有明顯改變，說明汗腺組織中引起自發(fā)熒光的物質(zhì)沒有隨汗腺的新陳代謝而明顯減少。細(xì)胞的自發(fā)熒光主要由內(nèi)在熒光基團(tuán)發(fā)出，如黃素和脂褐素等。黃素是在大多數(shù)代謝途徑（如糖、蛋白質(zhì)、脂肪和核酸的代謝通路）中必不可少的輔酶，其氧化和減少會(huì)產(chǎn)生不同量子產(chǎn)率。測(cè)量自發(fā)熒光可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞和組織能量代謝，反映細(xì)胞的新陳代謝水平[2,13]。采用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)小汗腺自發(fā)熒光有兩個(gè)峰值，分別接近于530 nm和590 nm。黃素參與細(xì)胞的呼吸鏈，其自發(fā)熒光來源于氧化反應(yīng)，熒光峰值在520 nm；脂褐素是細(xì)胞老化的標(biāo)志物，隨著新陳代謝逐漸增加，其自發(fā)熒光峰值在近600 nm[2]，與所測(cè)小汗腺細(xì)胞峰值均相近。由于黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值與本研究中所測(cè)得的小汗腺自發(fā)熒光峰值接近，因此推測(cè)引起小汗腺細(xì)胞發(fā)生自發(fā)熒光的物質(zhì)很有可能是黃素和脂褐素。黃素隨新陳代謝逐漸減少，脂褐素則隨新陳代謝有所增加，這可能是小汗腺的自發(fā)熒光隨新陳代謝沒有明顯變化的原因。

小汗腺自發(fā)熒光特點(diǎn)除了與自發(fā)熒光物質(zhì)有關(guān)外，其他影響因素包括切片的厚度和光源選擇[2,14]、生理病理情況、培養(yǎng)基以及溫度等。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)所用到的器皿作了嚴(yán)格處理，以充分減少背景熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。我們觀察所用的汗腺細(xì)胞均貼壁并且生長狀態(tài)良好，各項(xiàng)操作均遵循了無菌操作原則。觀察小汗腺自發(fā)熒光時(shí)嚴(yán)格控制時(shí)間以免造成汗腺細(xì)胞活性降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，蘇木素染色皮膚組織的自發(fā)熒光有助于幫助辨別小汗腺的組織結(jié)構(gòu)。單個(gè)小汗腺表現(xiàn)出自發(fā)熒光現(xiàn)象可能是由于存在自身熒光基團(tuán)—黃素和脂褐素，其與小汗腺新陳代謝的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

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Observation on autofl uorescence of eccrine sweat gland

Wang Binbin*, Zhang Cuiping, Zhao Zhili, Fu Xiaobing, Wang Li. * Department of Burns Plastic Surgery, Inner Mongolia People's Hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010017, China Corresponding author: Zhao Zhili (E-mail: zhilizhao@vip.sina.com)
Zhang Cuiping(E-mail: zcp666666@sohu.com)

AbstractObjective: To observe the autofluorescence phenomena of eccrine sweat glands and its changes with the growth or aging of eccrine sweat glands, and speculate the endogenous fluorophores to provide a new method for the study of eccrine sweat glands. Methods: Abandoned skin tissues of patients receiving the plastic surgery were collected and stained with haematoxylin-eosin (HE) to observe autofluorescence of eccrine sweat glands under a fluorescence microscope. Single eccrine sweat gland was extracted from the skin of volunteers and cultured in vitro. At 7, 14, 21, 28 days after cell adherence, the autofluorescence was observed after the cells was exposed to three kinds of exciting light respectively, wide ultraviolet, wide green, and wide blue, under the fluorescence microscope. The autofluorescence intensity of the single eccrine sweat gland was measured using a laser confocal scanning microscope. Results: Autofluorescence of HE stained eccrine sweat glands showed net structure with ostioles, and the boundary was clear. The autofluorescence of the eccrine sweat glands appeared green under wide blue excitation light and red under wide green excitation light. Moreover, the single eccrine sweat gland cell showed three autofluorescence colours under fluorescence microscope, including blue under wide ultraviolet, green under wide blue light and red under wide green light. The fluorescence intensity of the single eccrine sweat gland cell didnot decrease significantly with its growth. The result of the intensity of single eccrine sweat gland detected by hierarchical scanning using the laser confocal scanning microscope showed that two peaks were located at approximately 530 nm and 590 nm, which were similar to those of flavin and lipofuscin. Conclusions: Autofluorescence of HE-stained eccrine sweat gland sections in skin tissue is helpful for simply and rapidly judging the structure of eccrine sweat glands. Autofluorescence of single eccrine sweat gland does not decrease significantly along with its growth. According to autofluorescence intensity of the eccrine sweat gland, it is thought that flavin and lipofuscin may be the endogenous fluorophores.

Key words:Eccrine sweat gland;Autofluorescence;Fluorescence microscope;Confocal laser scanning microscope;Flavin;Lipofuscin

DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 003

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81571905）

通訊作者：趙志力，副主任醫(yī)師（E-mail: zhilizhao@vip.sina.com）通訊作者：張翠萍，副研究員（E-mail: zcp666666@sohu.com）

收稿日期：（2015-12-25）