應(yīng)用動(dòng)物模型研究氨基酮戊酸光動(dòng)力治療皮膚病的研究進(jìn)展

張國(guó)龍 周倩 王秀麗

應(yīng)用動(dòng)物模型研究氨基酮戊酸光動(dòng)力治療皮膚病的研究進(jìn)展

張國(guó)龍 周倩 王秀麗

氨基酮戊酸光動(dòng)力療法是一種無創(chuàng)、有效且不良反應(yīng)和毒副作用少的治療技術(shù)，已廣泛地應(yīng)用于皮膚科領(lǐng)域多種疾病的治療。動(dòng)物模型是研究氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療療效及機(jī)制的重要方法。近年來，通過應(yīng)用皮膚腫瘤、光老化、痤瘡、瘢痕以及銀屑病的動(dòng)物模型，優(yōu)化了氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療參數(shù)，進(jìn)一步闡明了氨基酮戊酸光動(dòng)力療法的治療機(jī)制，為氨基酮戊酸光動(dòng)力療法增敏劑的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

皮膚疾??；氨基酮戊酸；光化學(xué)療法；模型，動(dòng)物；小鼠；兔

氨基酮戊酸光動(dòng)力治療（ALA-PDT）是一種無創(chuàng)、有效且不良反應(yīng)少的治療技術(shù)［1］。臨床中新適應(yīng)證的開發(fā)、療效評(píng)估、治療參數(shù)的優(yōu)化以及治療不同疾病相關(guān)治療機(jī)制的探討均需借助動(dòng)物模型來完成。

1 皮膚腫瘤

ALA-PDT已用于治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、基底細(xì)胞癌、黑素瘤以及無色素性黑素瘤等［1］，其相關(guān)的動(dòng)物模型在ALA-PDT相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。

1.1 SCC小鼠模型：是應(yīng)用于該領(lǐng)域最早的動(dòng)物模型之一，其建模的方法主要有3種：①物理法，采用由 1根 TL 12燈管（Philips，Eindhoven，The Netherlands）和 5根 SA-1-12燈管（Wolff System，Atlanta，GA，USA）制成的日光模擬器（釋放波長(zhǎng)＞280 nm、峰值在365 nm左右的紫外光，UVA和UVB的輸出功率比為9∶1）SKH-1無毛小鼠進(jìn)行3倍標(biāo)準(zhǔn)紅斑量（0.924 J/cm2，每周3次）進(jìn)行累積照射，一般持續(xù)6個(gè)月即可在小鼠背部誘發(fā)SCC［2-3］；②化學(xué)法，在SKH-1 無毛小鼠，軀干側(cè)面外涂50 μg/100 μl的二甲基苯蒽丙酮溶液一次，然后再用5 μg/200 μl的佛波酯丙酮溶液連續(xù)外涂，每周2次，連用20周后停用，多在停藥后一段時(shí)間內(nèi)，在外涂藥的皮膚處會(huì)發(fā)生SCC［4］；③皮內(nèi)注射法，把人皮膚SCC的A431細(xì)胞（2×106）直接皮下注射至免疫受損的小鼠真皮內(nèi)，一般6～10 d后在注射處即可長(zhǎng)出肉眼可見的瘤體［4］。前兩種SCC動(dòng)物模型系理化因素作用在小鼠皮膚上產(chǎn)生的自發(fā)性SCC模型，而后者則是異種移植性SCC模型。鑒于SKH-1小鼠在紫外線累積照射下均會(huì)發(fā)生SCC，因此，可將該小鼠模型應(yīng)用到ALA-PDT預(yù)防SCC的實(shí)驗(yàn)研究中。Liu等［5］一方面給予SKH-1無毛小鼠每周3次的紫外線累積照射，另一方面給予小鼠每周1次的ALA-PDT治療（經(jīng)皮給藥和系統(tǒng)給藥），結(jié)果顯示，ALA-PDT可有效預(yù)防和延緩因紫外線照射導(dǎo)致SCC的發(fā)生。ALA-PDT可有效治療表淺或體積較小的皮膚腫瘤，對(duì)較大或較深的腫瘤療效多不佳。為提升ALA-PDT的療效，Anand等［4］在ALA-PDT治療增強(qiáng)劑的開發(fā)和應(yīng)用方面進(jìn)行了系列研究。最初，他們對(duì)ALA-PDT治療前的荷瘤小鼠進(jìn)行甲氨蝶呤預(yù)處理，結(jié)果顯示，無論是化學(xué)誘導(dǎo)或皮下接種的SCC小鼠模型，在ALA-PDT后原卟啉Ⅸ的蓄積都會(huì)得到有效提高。此后，他們又運(yùn)用同樣方法對(duì)骨化三醇的增效作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，不論是外用或腹膜內(nèi)給藥，只要對(duì)SCC小鼠進(jìn)行了預(yù)處理都可上調(diào)小鼠體內(nèi)的卟啉合成酶-糞卟啉原氧化酶和下調(diào)亞鐵螯合酶，使得給予ALA后腫瘤局部的原卟啉Ⅸ蓄積量均升高10倍，因此，骨化三醇對(duì)ALA-PDT增效作用顯著。不僅如此，骨化三醇的預(yù)處理還可降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶8并促進(jìn)腫瘤壞死因子（TNF）α的合成，進(jìn)而活化了腫瘤細(xì)胞外源性的凋亡通路，綜合以上骨化三醇的預(yù)處理增加了ALA-PDT治療后腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡的比率［6］。雖然用于荷瘤小鼠預(yù)處理的骨化三醇濃度很低（一般0.1～1 μg/kg），骨化三醇毒性作用幾乎可忽略不計(jì)，但從骨化三醇本身的藥理作用來講，仍存在導(dǎo)致高鈣血癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步降低這種潛在風(fēng)險(xiǎn)，Anand等［7］又通過治療前在食物內(nèi)增加食物源性天然維生素D3的方法對(duì)荷瘤小鼠和患者分別進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，不論是注射A431細(xì)胞的人體腫瘤異種移植性腫瘤動(dòng)物模型小鼠還是SCC患者，其療效都提升，且無任何不良反應(yīng)，因此，值得臨床推廣。有作者運(yùn)用日光模擬器進(jìn)行造模對(duì)ALA-PDT治療SCC的機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的探討，通過免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)ALA-PDT可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的快速凋亡，治療后TNF-α在腫瘤間質(zhì)和皮下組織內(nèi)高表達(dá)，且樹突細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞的組織浸潤(rùn)程度也增加；證實(shí)ALA-PDT治療可誘發(fā)腫瘤局部組織的特異性抗瘤反應(yīng)，但這種特異性抗瘤免疫反應(yīng)在治療后能否長(zhǎng)效發(fā)揮作用尚待研究［2，8］。

作者單位：200443 上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學(xué)治療科 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所

1.2 基底細(xì)胞癌小鼠模型：Sunar等［9］用 K5-Gli轉(zhuǎn)基因的基底細(xì)胞癌小鼠模型，證實(shí)空間頻域成像系統(tǒng)可有效檢測(cè)ALA孵育后腫瘤局部PpⅨ的絕對(duì)熒光強(qiáng)度。Rollakanti等［10］選用 6周齡的 Ptch1+/-K14-Cre-ER p53 flox/flox基因小鼠，腹腔內(nèi)注射他莫昔芬100 mg，連續(xù)注射3 d，在小鼠8周齡時(shí)給予4 Gy離子輻射，一般6～8個(gè)月時(shí)，可形成多發(fā)的基底細(xì)胞癌，利用該模型發(fā)現(xiàn)，骨化三醇預(yù)處理可使得ALA孵育后腫瘤局部的原卟啉Ⅸ的蓄積升高了6倍以上，此外骨化三醇還可誘導(dǎo)基底細(xì)胞癌的分化、增殖和凋亡，從而增強(qiáng)了ALA-PDT對(duì)基底細(xì)胞癌的療效。

1.3 惡性黑素瘤動(dòng)物模型：金屬硫蛋白/受體酪氨酸激酶（MT-ret 304/B6）融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠常作為惡性黑素瘤的動(dòng)物模型，80%該類小鼠皮膚都表現(xiàn)為癌前病變樣的黑變病樣外觀，且這些發(fā)生黑變的皮膚在1年內(nèi)會(huì)發(fā)生皮膚黑素瘤，發(fā)生部位主要集中在背部、面部、背部側(cè)面以及四肢。臨床上ALA-PDT治療惡性黑素瘤的研究一度顯示出一種矛盾的結(jié)果，即黑素細(xì)胞系和黑素細(xì)胞植入的動(dòng)物模型對(duì)ALA-PDT都很敏感，而自發(fā)的惡性黑素瘤患者對(duì)ALA-PDT治療幾無療效。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該現(xiàn)象并探討其原因，Córdoba 等［11］利用 MT-ret融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)了相關(guān)研究，結(jié)果證實(shí)，MT-I小鼠的黑素瘤細(xì)胞在體外對(duì)ALA-PDT確實(shí)有效，而自發(fā)于該小鼠皮膚上的黑素瘤對(duì)ALA-PDT無效，其機(jī)制可能與在體黑素瘤瘤體內(nèi)的黑素阻擋了ALA-PDT的光照和在體黑素瘤浸潤(rùn)相對(duì)較深有關(guān)。無色素性黑素細(xì)胞瘤動(dòng)物模型是通過皮下注射將無色素性黑素瘤細(xì)胞植入敘利亞金色倉鼠背部皮膚的皺褶內(nèi)進(jìn)行造模。Schacht等［12-13］通過系統(tǒng)注射和外用給藥的方法分別對(duì)荷瘤的敘利亞金色倉鼠進(jìn)行了ALA-PDT，以探討不同給藥方式對(duì)腫瘤微循環(huán)作用的差異，結(jié)果顯示，高能量（100 J/cm2）的光動(dòng)力治療時(shí)，外用給藥較系統(tǒng)給藥對(duì)腫瘤微循環(huán)的效應(yīng)更強(qiáng)。

2 其他皮膚病

ALA-PDT可有效改善皮膚光老化［14］。光老化造模方法是選用飛利浦公司的熒光紫外燈（波段275～380 nm，波峰310～315 nm）為光源，過濾掉短波紫外線（＜290 nm）后直接對(duì)6周齡左右的SKH-1無毛小鼠進(jìn)行5～10周的累積照射，一般首次劑量從1.3個(gè)最小紅斑量開始，每周增加0.5～1個(gè)紅斑量，最高劑量為3個(gè)紅斑量，每周3次照射，直至完成10 周的累積照射［15］。Lv 等［16］最早將光老化小鼠動(dòng)物模型應(yīng)用于ALA-PDT改善光老化治療機(jī)制方面的研究，通過研究證實(shí)，在體二次諧波顯微和定量膠原分析技術(shù)是評(píng)價(jià)ALA-PDT誘使膠原變化的有效方法，結(jié)合組織病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)多次小劑量的ALA-PDT治療光老化皮膚后，可以改變病變皮膚組織內(nèi)膠原的密度和排列，從而達(dá)到皮膚年輕化的效果。其后，Park等［17］應(yīng)用類似的動(dòng)物模型，對(duì)ALA-PDT治療前后的皮膚進(jìn)行了組織病理學(xué)對(duì)比分析，結(jié)果顯示，ALA-PDT可促進(jìn)皮膚膠原在真皮內(nèi)的沉積，減少真皮內(nèi)的彈性纖維狀物質(zhì)，同時(shí)在恢復(fù)成纖維細(xì)胞形態(tài)方面還可能起直接作用，從而達(dá)到改善皮膚光老化的作用。

ALA-PDT可有效治療痤瘡，尤其適合中重度炎癥痤瘡的治療［18］，但常伴嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如疼痛和治療后紅斑。為了避免或減少這些不良反應(yīng)，Nakano等［19］運(yùn)用杰克遜實(shí)驗(yàn)室的犀牛小鼠（hrrhhrrh）作為痤瘡模型進(jìn)行了研究。犀牛小鼠出生后會(huì)有較短的鼠毛長(zhǎng)出，但4周后會(huì)出現(xiàn)毛發(fā)不可逆性的脫失，最終成為無毛小鼠，脫毛后殘留的皮脂腺濾泡在組織學(xué)上類似人類疾病痤瘡中的黑頭粉刺，因此，可以把其作為黑頭粉刺的疾病模型進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物研究。Kosaka等［20］運(yùn)用不同的ALA濃度和不同的敷藥時(shí)間對(duì)該小鼠模型進(jìn)行了系列的ALA-PDT治療，結(jié)果提示，低濃度ALA（2.5%～5.0%）給藥和短時(shí)間敷藥（1～2 h）可以達(dá)到針對(duì)于皮脂腺的光動(dòng)力療效，為臨床上減少光動(dòng)力治療痤瘡過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)，如疼痛和紅斑提供了思路。

ALA-PDT也可治療增生性瘢痕。新西蘭大白兔的兔耳瘢痕模型是經(jīng)典的瘢痕動(dòng)物模型［21］。Wang等［22］選取2.0～2.5 kg的新西蘭大白兔，在其每側(cè)耳內(nèi)側(cè)分別取四處切口，大小1 cm2，手術(shù)當(dāng)天切口用無菌紗布覆蓋，通過3周的自然愈合會(huì)在切口處形成高出正常皮面2 mm的增生性瘢痕；通過對(duì)兔耳瘢痕治療前后組織病理學(xué)分析以及RT-PCR研究證實(shí)，ALA-PDT可以有效抑制增生性瘢痕的形成，具體機(jī)制可能與ALA-PDT升高了增生性瘢痕局部金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑的比例，從而加速了皮損內(nèi)成纖維細(xì)胞的老化以及膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的降解相關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道，外用ALA-PDT可以安全有效地治療大面積的銀屑病皮損［23］。銀屑病皮損常過度增生，因此ALA能否有效吸收成為療效的關(guān)鍵所在。Demerjian等［24］運(yùn)用膠膜帶在小鼠背部局部皮膚上反復(fù)進(jìn)行淺表剝離（每天2次，共5 d），成功地在小鼠背部造成皮膚過度增生的類銀屑病的皮損表現(xiàn)。為了改變傳統(tǒng)ALA水溶液吸收不良的問題，在銀屑病的動(dòng)物模型上結(jié)合新興材料的應(yīng)用以提高ALA吸收的研究成為必要。Fang等［25］通過以上銀屑病的動(dòng)物模型，結(jié)合短鏈醇類的磷脂脂質(zhì)體作為ALA的載體，以期增加ALA經(jīng)皮吸收率，結(jié)果顯示，應(yīng)用短鏈醇類的磷脂脂質(zhì)體作為載體，可有效增加ALA的透皮吸收，與ALA水溶液相比，在正常和過度增生的皮膚上分別提高了5和26倍，吸收的增加提高了目標(biāo)組織內(nèi)原卟啉Ⅸ的密度，毋庸置疑也提高了ALA-PDT的療效。

3 結(jié)語

通過ALA-PDT治療皮膚病相關(guān)動(dòng)物模型的研究，有效優(yōu)化了各種疾病ALA-PDT治療的參數(shù)，提高了ALA-PDT的療效并為闡明ALA-PDT治療不同皮膚病的治療機(jī)制提供了可能。相信隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷提高，更多相關(guān)的動(dòng)物模型會(huì)被進(jìn)一步開發(fā)，有助于ALA-PDT技術(shù)在皮膚科領(lǐng)域的應(yīng)用。

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The use of animal models in researches on aminolevulinic acid-based photodynamic therapy for the treatment of skin diseases

Zhang Guolong,Zhou Qian,Wang Xiuli.Department of Phototherapy,Shanghai Dermatology Hospital;Institute of Photomedicine,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200443,China

Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy （ALA-PDT）,a kind of non-invasive and effective treatment strategy with less adverse effects,has been widely applied in the treatment of various diseases in dermatology.Animal models are an important means to assess therapeutic effects and mechanisms of ALA-PDT.In recent years,the use of animal models for skin neoplasms,photoaging,acne,scar and psoriasis have optimized treatment parameters of ALA-PDT,further clarified therapeutic mechanisms of ALA-PDT,and provided theoretical basis for the development and application of sensitizers in ALA-PDT.

Skin diseases;Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Models,animal;Mice;Rabbits

Wang Xiuli,Email:wangxiuli20150315@163.com

2015-10-13）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201222、81472538）；上海市自然科學(xué)基金（15411950302）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81201222、81472538）;Shanghai Municipal Natural Science Foundation （15411950302）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.05.014

王秀麗，Email:wangxiuli20150315@163.com