RhoC在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá)及意義

崔丹丹 張麗雅 武昕

RhoC在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá)及意義

崔丹丹 張麗雅 武昕

目的探討RhoC在外陰鱗狀細(xì)胞癌(外陰鱗癌)及外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)情況,分析其在外陰疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。方法采用免疫組化方法檢測RhoC在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá),并收集30例外陰鱗癌患者的臨床病理資料進(jìn)行分析。結(jié)果RhoC在外陰正常組織、外陰硬化性苔蘚、外陰鱗癌中陽性細(xì)胞的平均光密度值分別為(22.42±1.23)、(36.07±2.75)、(83.51±2.84)。與外陰正常組織相比,RhoC在外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)顯著增高(P<0.05)。在外陰鱗癌中的表達(dá)顯著高于其在外陰硬化性苔蘚與外陰正常組織中的表達(dá) (P<0.05)。RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外陰鱗癌組織中表達(dá)顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。RhoC的表達(dá)與細(xì)胞分化及年齡無關(guān)。結(jié)論RhoC的表達(dá)與外陰鱗癌及外陰硬化性苔癬的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

RhoC；外陰鱗狀細(xì)胞癌；外陰硬化性苔蘚；免疫組化

RhoC是Rho基因家族的成員之一,其具有GTP酶活性。Rho蛋白在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移、惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道RhoC在乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、食管鱗癌、前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá),并與這些腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)［1-4］。外陰硬化性苔癬(vulvar lichen sclerosus,VLS)是一種常見的外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變,以40歲左右的婦女多見,其次是幼女,主要癥狀為外陰搔癢、性交痛及外陰燒灼感。其中約有4%～7%患有外陰硬化性苔蘚的婦女發(fā)展為外陰癌［5］。外陰鱗狀上皮癌占外陰惡性腫瘤的80%以上,約60%左右患者合并有外陰硬化性苔蘚［6］。目前兩種疾病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全弄清,并且外陰硬化性苔蘚在什么情況下會進(jìn)展為外陰鱗癌尚不清楚。因此本研究運(yùn)用免疫組化的方法探討RhoC的表達(dá)與外陰硬化性苔癬和外陰鱗癌發(fā)生、發(fā)展是否相關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月～2013年7月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科55例患者經(jīng)手術(shù)切除及活檢存檔的蠟塊,其中包括30例外陰鱗癌,15例外陰硬化性苔蘚,10例正常外陰皮膚。所有患者臨床及病理資料均完整,所有標(biāo)本均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師確認(rèn),術(shù)前均未行放化療。收集外陰鱗癌患者的臨床及病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：年齡36～68歲,平均年齡(52.8±5.9)歲。30例外陰鱗癌患者依據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ期8例,Ⅱ期15例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例；分化程度：高分化18例,中分化7例,低分化5例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人RhoC多克隆抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色液均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 石蠟切片均進(jìn)行常規(guī)的脫蠟水化。3% H2O2于室溫孵育10min從而滅活內(nèi)源性過氧化物酶,然后再進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加5%BSA封閉液,室溫20min,滴加適當(dāng)一抗RhoC(1∶100)于4℃冰箱過夜,再滴加相對應(yīng)的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30min,鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物工作液室溫下孵育20min,最后進(jìn)行DAB顯色,蘇木素復(fù)染,再進(jìn)行封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結(jié)果判定 陽性染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒,運(yùn)用BX60萬能顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS,日本)對切片進(jìn)行圖像采集,每張切片中選取5個(gè)不同視野,利用顯微圖像分析系統(tǒng)Meta Morph(UIC/ OLUMPUS.US/JP)計(jì)算每張切片的平均積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoC在外陰不同組織中的表達(dá)情況 RhoC蛋白于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上呈棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。正常外陰組織中能夠表達(dá)RhoC蛋白的細(xì)胞分布于基底細(xì)胞層,但在外陰硬化性苔蘚中陽性表達(dá)細(xì)胞位于表皮中上層,在真皮細(xì)胞中未見此蛋白表達(dá)。在外陰鱗癌中的表達(dá)主要分布在癌巢的異型細(xì)胞中。RhoC在外陰正常組織中陽性細(xì)胞的平均光密度值為(22.42±1.23),在外陰硬化性苔蘚中表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光密度值為(36.07±2.75),外陰鱗癌中RhoC蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光密度值為(83.51±2.84)。RhoC蛋白在外陰鱗癌、外陰硬化性苔蘚與外陰正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且其在外陰鱗癌中的表達(dá)顯著高于其在外陰硬化性苔蘚的表達(dá) (P<0.05)。見表1。

表1 RhoC在外陰不同組織中的表達(dá)情況(±s)

表1 RhoC在外陰不同組織中的表達(dá)情況(±s)

注：與外陰正常組織比較,aP<0.05；與外陰硬化性苔蘚比較,bP<0.05

組織 例數(shù) 平均光密度值外陰正常組織 10 22.42±1.23外陰硬化性苔蘚 15 36.07±2.75a外陰鱗癌 30 83.51±2.84ab

2.2 RhoC的表達(dá)與外陰鱗癌的臨床病理特征的關(guān)系 RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外陰鱗癌中表達(dá)為(74.13±2.73),Ⅲ～Ⅳ期為(89.69±1.23),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在不同病理分級中表達(dá)為:高分化為(79.06±5.85),中低分化為(82.12±2.62)。不同病理分級比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為(86.23±1.59),明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(74.63±2.56)(P<0.05)；RhoC的表達(dá)與年齡無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 30例外陰鱗癌患者RhoC的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

表2 30例外陰鱗癌患者RhoC的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

注：不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,aP<0.05

指標(biāo) 例數(shù) RhoC P年齡 ≤45歲 7 82.50±1.70 >0.05 >45 23 80.32±2.01臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期 23 74.13±2.73a<0.05Ⅲ～Ⅳ期 7 89.69±1.23病理分級 高分化 18 79.06±5.85 >0.05中低分化 12 82.12±2.62淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 22 74.63±2.56a<0.05有8 86.23±1.59

3 討論

在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中,細(xì)胞因子間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。研究顯示［6］,Ras超家族中Rho亞家族是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要因子,其在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中主要是參與細(xì)胞骨架重組、應(yīng)力纖維形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、極性、運(yùn)動等。研究者根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同,將已發(fā)現(xiàn)的約20個(gè)Rho GTP酶超家族成員的大致分為5個(gè)亞家族,包括Rho亞家族,此亞家族又包括RhoA、RhoB 及RhoC三位成員。研究表明在大多數(shù)原發(fā)腫瘤中,RhoC發(fā)揮積極的調(diào)節(jié)作用。RhoC全稱為Ras同源類似物C,RhoC的CDS全長為582bp,在基因組中的全長約為5 kb,定位于染色體1p21-p13。RhoC蛋白含193個(gè)氨基酸。RhoC 蛋白在細(xì)胞的多種生命過程均積極參與,其中最為重要的是調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架活動,其中,RhoC蛋白與樁蛋白(paxillin)、粘著斑激酶(FAK)、內(nèi)收蛋白(adducing)和肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain,MLC)等細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化直接相關(guān),并且還參與了細(xì)胞運(yùn)動和遷移的調(diào)節(jié)。RhoC蛋白通過向下游靶效應(yīng)分子ROCK (Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK)傳遞活化信號,繼而磷酸化多個(gè)氨基酸位點(diǎn),激活并介導(dǎo)下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)［7,8］。通過以上途徑對調(diào)控細(xì)胞骨架的重建,同時(shí)參與并影響細(xì)胞遷移、增殖、轉(zhuǎn)錄、惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤等多種生物學(xué)行為［9］。

在人類的惡性腫瘤中,有報(bào)道稱對RhoC蛋白在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌中過度表達(dá),與之相一致,研究發(fā)現(xiàn)RhoC蛋白在外陰正常組織中弱表達(dá),在外陰硬化性苔蘚及外陰癌中高表達(dá),而且與外陰正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),推測其與外陰硬化性苔蘚及外陰癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)行為在外陰硬化性苔蘚病變的發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用,具體調(diào)節(jié)機(jī)制則有待進(jìn)一步研究探討。另外,RhoC 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期高的外陰癌病例中高表達(dá)。RhoC蛋白促進(jìn)惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能如下：①RhoC 蛋白通過 ROCK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)肌動蛋白微絲骨架的聚合過程,進(jìn)而影響細(xì)胞形態(tài)和極性,此通路還能促進(jìn)惡性腫瘤血管生成、協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿越脈管內(nèi)皮從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［10,11］；②RhoC 蛋白可通過影響細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-胞外基質(zhì)的粘附從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移；③RhoC 蛋白可以影響金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extraceller matrix,ECM)的降解及重建,促進(jìn)局部浸潤的發(fā)生；④RhoC蛋白可以激活磷脂酶 C(PLC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等多種酶類的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.22.010

2016-10-24］

110000 沈陽市婦嬰醫(yī)院(崔丹丹 張麗雅)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(武昕)

武昕