細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨的研究進(jìn)展

劉道華綜述,夏德林審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,四川瀘州646000)

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)被認(rèn)為是骨組織工程中最有應(yīng)用前景的理想種子細(xì)胞[1]。由于BMSCs具有分化多方向性的特點(diǎn),而骨組織工程學(xué)要求其向單一方向分化,所以,BMSCs的定向誘導(dǎo)具有重要作用。就其成骨方向來說,常用的具有誘導(dǎo)作用生長(zhǎng)因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等。它們不僅可單獨(dú)作用,相互之間也存在著密切的關(guān)系,可復(fù)合使用。本文就細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)BMSCs分化及增殖的誘導(dǎo)作用作一綜述。

1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一組疏水性的酸性糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子超家族。BM P是一組具有很強(qiáng)骨誘導(dǎo)活性的生長(zhǎng)因子,可能是誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的基本信號(hào)因子,其中研究最多也是成骨活性最強(qiáng)的是BMP-2和BMP-7。BMP-2可明顯加速BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究表明,BM P首先與細(xì)胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體相結(jié)合,形成Ⅰ、Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的二聚體,然后將信息轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),經(jīng)第 2信使M AD(matheragainst dpp)的磷酸化,將信息導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi),從而激活或調(diào)整DNA的結(jié)合活性,使BMP活性相關(guān)的基因表達(dá),產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。

對(duì)BM P的骨誘導(dǎo)活性人們看法比較一致,其在體內(nèi)通過募集間充質(zhì)細(xì)胞,并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞方向分化,同時(shí)協(xié)同其他調(diào)節(jié)因子共同參與誘導(dǎo)骨形成;在體外不僅能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,對(duì)骨祖細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞均具有強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)活性,而且可能使誘導(dǎo)性骨細(xì)胞向確定性骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但其對(duì)細(xì)胞增殖的影響目前尚有爭(zhēng)論。Akino等[2]用BMP-2及bFGF誘導(dǎo)人BMSC發(fā)現(xiàn)用BMP-2誘導(dǎo)的無血清培養(yǎng)的BMSC在2d時(shí)細(xì)胞數(shù)目顯著增多并達(dá)到平臺(tái)期,且BMP-2和bFGF有明顯的協(xié)同作用二者合用可使平臺(tái)期后延。用熒光激活分選術(shù)進(jìn)一步表明BMP-2使細(xì)胞周期前移G2/M期細(xì)胞比例增多。研究證實(shí),重組人BM P-2(rhBMP-2)能夠提高人BM SC及肋骨來源的成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素、Ⅰ型膠原 mRNA的表達(dá)。Boden[3]以 LMP-1(潛在性膜蛋白-1)cDNA轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞,在脊柱融合模型中局部植入可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組100%脊柱融合,而對(duì)照組未見成骨。有研究表明用地塞米松處理成纖維樣的骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)BMP-2,而ascorbic acid作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞時(shí),發(fā)現(xiàn)它可通過誘導(dǎo)Ⅰ型膠原形成,繼而激活包括BMPs的信號(hào)通路,促進(jìn)骨基質(zhì)細(xì)胞系ST2細(xì)胞的成骨性分化。用simvastatin作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以增加osteocalcin mRNA的表達(dá)與堿性磷酸酶的活性,誘導(dǎo) BMP-2的表達(dá),促進(jìn)成骨[4-5]。有學(xué)者運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),在表達(dá)載體的作用下,產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2二聚體,并分泌到細(xì)胞外,誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化,促進(jìn)骨組織生成[6-9]。

2 成纖維細(xì)胞生成因子(fibroblast growth factor,FGF)

根據(jù)等電點(diǎn)的不同,將其分為酸性和堿性兩種,廣泛存在于腦、垂體、肝、腎、骨、軟骨等多種組織細(xì)胞中,是一種廣譜的有絲分裂源,對(duì)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有明顯的促增殖作用,不僅能夠促進(jìn)軟骨及骨組織的形成,并且是一種強(qiáng)烈的毛細(xì)血管形成刺激劑[10],也是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子,在正常生理和病理過程中參與生長(zhǎng)發(fā)育和組織損傷修復(fù)過程。bFGF能夠促進(jìn)BMSCs體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞集落的形成,促進(jìn)細(xì)胞的增殖,但對(duì)BMSCs的轉(zhuǎn)化作用仍存在不同的研究結(jié)果。有研究證實(shí)在地塞米松存在的培養(yǎng)環(huán)境中,bFGF作用6d時(shí)可顯著增加細(xì)胞增殖,同時(shí)骨鈣蛋白表達(dá)、骨礦化結(jié)節(jié)形成。BMP-2的促轉(zhuǎn)化作用不如bFGF明顯,兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)促BM SCs轉(zhuǎn)化作用強(qiáng)于單一因子。在眾多生長(zhǎng)因子中bFGF對(duì)BMSCs具有最強(qiáng)的促分裂作用,同時(shí)經(jīng)bFGF作用的細(xì)胞植入體內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的成骨能力。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18是新近克隆的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一,已被證實(shí)是一種發(fā)育組織重要的分泌性信號(hào)分子,在骨骼和軟骨的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)有 FGF的受 體,對(duì)FGF有良好的反應(yīng),體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),其對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化為成骨細(xì)胞的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于BMP-2。有實(shí)驗(yàn)觀察到FGF-2在體外可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化增殖,FGF-2處理骨髓基質(zhì)細(xì)胞后可顯著增加它們的增殖潛能以及子代細(xì)胞的數(shù)量與克隆的大小,提高非造血前體細(xì)胞與骨髓成纖維細(xì)胞表面分化抗原與堿性磷酸酶的表達(dá),在加入地塞米松后可促進(jìn)其進(jìn)一步的成熟。

3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)

TGF-β是一族具有多種功能的蛋白多肽,相對(duì)分子質(zhì)量100～250kd,廣泛存在于人體組織中的生長(zhǎng)因子,以骨和血小板中含量最高,參與人體許多組織的炎癥和修復(fù)反應(yīng),是較強(qiáng)的促成骨分化的因子。

體外實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β可促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)成骨和成軟骨細(xì)胞的增殖,刺激Ⅱ型膠原、骨粘連蛋白和骨橋蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)TGF能夠抑制BMSCs的增殖,但能提高其成骨細(xì)胞ALP的表達(dá),并能減少和延遲BMSCs向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?；蛑亟M人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β可以誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化和成熟。有研究表明 TGF-β1和BMP在對(duì)基質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞方向分化的作用是不同的,TGF-β1在基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的早期階段起關(guān)鍵作用,而BM P則促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的存活和成熟。TGF-β對(duì)BMSC的作用與細(xì)胞分化程度有關(guān),早期促進(jìn)增殖晚期促進(jìn)分化。TGF-β對(duì)多種細(xì)胞具有促分化效應(yīng),是較強(qiáng)的促成骨分化的因子。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠抑制BMSC增殖,但能提高其ALP的表達(dá),并能減少和延遲BMSC向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而提高BMSC的成骨效應(yīng)。

4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

VEGF是一種糖蛋白,其相對(duì)分子質(zhì)量為 34～45kd,由兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量各為17～22kd的不同亞單位組成的二聚體。人類VEGF基因位于染色體 6P12,全長(zhǎng) 14kb,由 8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。由于VEGF mRNA有不同的剪接方式,所產(chǎn)生的VEGF蛋白主要有5種亞型,近年來研究表明,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)中胚層細(xì)胞分化有作用,可以使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。有研究發(fā)現(xiàn),外源性VEGF能使體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞ALP活性及cAM P濃度提高4倍。VEGF誘導(dǎo)成骨細(xì)胞遷移,增加ALP活性,同時(shí)成骨細(xì)胞自身合成VEGF。PGE1,PGE2,1、25(OH)維生素D3及IGF2Ⅰ能增加成骨細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)。

通過對(duì)外源性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子修復(fù)鼠下頜骨缺損進(jìn)行組織學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組標(biāo)本內(nèi)血管形成明顯增加,骨組織的再生也增加,證實(shí)了局部應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子能促進(jìn)骨組織再生[12]。近年來有研究證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在血管再生中起著重要作用。它通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、血管通透性的增加及增進(jìn)單核細(xì)胞的趨化性等促進(jìn)血管的再生。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子不僅能促進(jìn)血管的再生,而且能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成骨活性,使其能更好地分泌細(xì)胞外基質(zhì),從而促進(jìn)成骨。

5 胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF-1)

IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽,相對(duì)分子質(zhì)量7.7kd,由3個(gè)二硫鍵交叉連接,被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞合成代謝的主要促生長(zhǎng)因子。IGF-1通過與IGFBPs(IGF-binding protein)相互作用來調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。IGF-1可刺激單層培養(yǎng)中人軟骨細(xì)胞的增殖,且與其劑量呈正相關(guān)。Kellner等[13]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IGF-1在體外軟骨組織工程中具有顯著的正面效應(yīng)。而胰島素也被證明能夠與IGF-1的受體相結(jié)合,并產(chǎn)生相同的效應(yīng)。他們?cè)谠囼?yàn)中將牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在多聚葡酸(PGA)支架上培養(yǎng)7周。結(jié)果顯示體外胰島(0.05～50mg/mL)能夠促進(jìn)組織工程軟骨的生長(zhǎng)速度及多聚葡酸的聚集,并能優(yōu)化軟骨形態(tài),其中以2.5mg/mL的濃度時(shí)效應(yīng)最為明顯。IGF-1與透明質(zhì)酸聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有顯著的促進(jìn)組織工程軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[14]。IGF-1與bFGF或 TGF-β2的混合物也可明顯促進(jìn)組織工程軟骨的發(fā)生以及Ⅱ型膠原的生長(zhǎng)[15]。

6 基因修飾(gene-modified)

許多生長(zhǎng)因子如 BM P-2、BMP-7、TGF-β、bFGF等不僅可通過人工基因重組產(chǎn)生,而且能以病毒或非病毒載體通過體外轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入BMSC內(nèi)并有效表達(dá),用來修復(fù)骨缺損取得了良好的效果。有學(xué)者利用腺病毒通過體外轉(zhuǎn)移的方法將BMP-2基因?qū)牍撬杌|(zhì)細(xì)胞,然后將該骨髓細(xì)胞與脫礦骨基質(zhì)復(fù)合后修復(fù)小鼠股骨缺損,術(shù)后2個(gè)月,24處骨缺損中有22處骨性愈合[16]。有學(xué)者比較了腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體載體對(duì)轉(zhuǎn)hBMP-2基因小鼠MSC修復(fù)顱骨缺損的效果差異,發(fā)現(xiàn)腺病毒組成骨效果最顯著,脂質(zhì)體組最少。研究表明將TGF-β1基因的復(fù)制缺陷型病毒轉(zhuǎn)入成骨細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)仍保持在明顯的上調(diào)狀態(tài),細(xì)胞分泌合成的TGF-β1較對(duì)照組高 46倍,細(xì)胞Ⅰ型膠原含量提高了5倍,將轉(zhuǎn)染了 TGF-β1的成骨細(xì)胞植入體內(nèi)可明顯增加新生骨組織的數(shù)量?；蛐揎椄杉?xì)胞,可實(shí)現(xiàn)BMSC在體外長(zhǎng)期擴(kuò)增并維持某些干細(xì)胞的多向分化潛能特性,文獻(xiàn)證實(shí)利用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修飾的MSC體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3年后,仍保持良好的自我更新和多向分化潛能[17]。利用TERT基因修飾的MSCs建立種子細(xì)胞庫(kù)有可能解決目前骨組織工程臨床應(yīng)用中種子細(xì)胞來源的難題,但其所致永生化細(xì)胞是否有致瘤性尚需進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)采用局部基因治療的方式,將攜帶有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2真核表達(dá)載體導(dǎo)入機(jī)體特定部位的細(xì)胞內(nèi),通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有誘導(dǎo)異位成骨作用,并能有效促進(jìn)兔橈骨缺損的修復(fù)[18]。

細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過調(diào)節(jié)BMSC增殖、分化過程并改變細(xì)胞產(chǎn)物的合成而作用于成骨過程,隨著基因技術(shù)的發(fā)展,對(duì)基因載體的研究日益受到研究者的重視。目前報(bào)道應(yīng)用的基因載體有真核表達(dá)載體cDNA載體、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴空泡病毒(SV40)等。將編碼特定生長(zhǎng)因子的基因?qū)隑M SC,使目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并合成具有骨誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子,從而克服了外源性生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短、需反復(fù)給藥、大劑量給藥有不良反應(yīng)等缺點(diǎn),是骨組織工程的又一重要研究方向。

[1]Bonab M M,Alimoghaddam K,Talebian F,et al.Aging of mesenchymal stem cell in vitro[J].BMC Cell Biol,2006,7:14.

[2]Akino K,Mineta T,Fukui M,et al.Bone morphogenetic protein 2 regulates proliferation of human mesenchymal stem cells[J].Wound Repair Regen,2003,11(5):354.

[3]Boden SD.Biology of lumbar spine fusion and use of bone graft substitutes:present,future,and next generation[J].Tissue Eng,2000,6(4):383.

[4]Somg C,Darg G,Jia H,et al.Simvastatin induces estenhlastic diffeentiation of bonellmrnw stronal cells[J].Beijin Da Xue Xue Bao,2003,35(5):533.

[5]Song C,Guo Z,Mz Q,et al.Simvastatin induces esteoblastic differentiation and inhibits adipecytic differentiation in minse boneⅡmnDw stromal cells[J].Bioechem Biophys Res Commun,2003,308:458.

[6]Jiang S,Zhang S,Langenfeld J,et al.Mycoplasma infection transforms normal lung cells and induces bone morphogenetic protein 2 expression by post-transcriptional mechanisms[J].J Cell Biochem,2008,104(2):580.

[7]Vogt S,Ueblacker P,Geis C,et al.Efficient and stable gene transfer of growth factors into chondrogenic cells and primaryarticularchondrocytes usinga VSV.G pseudotyped retroviral vector[J].Biomaterials,2008,29(9):1242.

[8]Liu HW,Chen CH,Tsai CL,et al.Heterobifunctional poly(ethylene glycol)-tethered bone morphogenetic protein-2-stimulated bone marrow mesenchymal stromal cell differentiation and osteogenesis[J].Tissue Eng,2007,13(5):1113.

[9]Shirasawa S,Sekiya I,Sakaguchi Y,et al.In vitro chondrogenesis of human synovium-derived mesenchymal stem cells:optimal condition and comparison with bone marrow-derived cells[J].J Cell Biochem,2006,97(1):84.

[10]Simons M.Integrative signaling in angiogenesis[J].Mol Cell Biochem,2004,264(1-2):99.

[10]Bhindi R,Brieger D,Ishii H,et al.Fibroblast growth factor 2 and the transcription factor Egr-1 localise to endothelial cell microvascular channels in human coronary artery occlusion[J].Thromb Haemost,2005,93(1):172.

[11]Ohbayahi N,Shibayma M,Kuretaki Y,et al.FGFI 8 is required for normal cell proliferation and differentiation during osteogenesis a nd chondregenesis[J].Genes Dev,2002,16(7):870.

[12]Yamashima T,Yoshimura K,Morita O,et al.Histological study of bone regeneration using vascular endothelial growth factor on rat mandibular bone defect[J].Nihon Hotetsu Shika Gakkai Zasshi,2005,49(5):726.

[13]Kellner K,Schulz MB,Gopferich A,et al.Insulin in Tissue Engineering of Cartilage:A Potential Model System for Growth Factor Application[J].J Drug Targeting,2001,9(6):439.

[14]Huang JR,Liu SL,Song WD.Stimulation of insulin-like growth factor-I to chondrogenesis of engineering cartilage tissue[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2004,18(1):49.

[15]Chua KH,Aminuddin BS,Fuzina NH,et al.Interaction between insulin-like growth factor-1 with other growth factors in serum depleted culture medium for human cartilage engineering[J].Med J Malaysia,2004,59(Suppl B):7.

[16]Blum JS,Barry MA,Mikos AG,et al.In vivo evaluation of gene therapy vectors in ex vivo-derived marrow stromal cells for bone regeneration in a rat critical-size calvarial defect model[J].Hum Gene Ther,2003,14(18):1689.

[17]Abdallah BM,Haack-Sorrensen M,Burns JS,et al.Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite〔corrected〕 extensive proliferation[J].Biochem BiophyRes Commun,2005,326(3):527.

[18]Tian XB,Sun L,Yang SH,et al.Osteogenic potential of the human bone morphogenetic protein 2 gene activated nanobone putty[J].Chin Med J(Engl),2008,121(8):745.