Keap1-Nrf2/ARE信號通路在糖尿病腦缺血中的保護作用

鄧才洪，韓江全

(珠海市遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院珠海醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

Keap1-Nrf2/ARE信號通路在糖尿病腦缺血中的保護作用

鄧才洪，韓江全

(珠海市遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院珠海醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

當(dāng)糖尿病腦缺血發(fā)生時機體立即啟動抗氧化應(yīng)激機制，此時內(nèi)源性Keap1-Nrf2/ARE信號通路被激活，調(diào)控下游多種細(xì)胞因子、蛋白酶體及Ⅱ相解毒酶對缺血缺氧腦細(xì)胞啟動抗氧化應(yīng)激保護機制，對受損的腦細(xì)胞給予相應(yīng)保護。啟動抗氧化應(yīng)激后Keapl-Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中解離，隨后Nrf2進入核內(nèi)與ARE相結(jié)合抑制氧化應(yīng)激引起的腦細(xì)胞、缺血半暗帶損傷以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗，從而達到對糖尿病腦缺血的神經(jīng)保護作用。本文將初步闡述該通路在糖尿病腦缺血中的作用機制。

糖尿?。荒X缺血；氧化應(yīng)激；Keap1-Nrf2/ARE通路

腦卒中具有高致殘率、致死率，是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。大量研究表明糖尿病引起的缺血性腦卒中占腦卒中總體的1/5～1/4，且其腦缺血面積更大、癥狀嚴(yán)重、較其他缺血性腦卒中更易形成進展性卒中，預(yù)后相對較差[1]。當(dāng)發(fā)生缺血性腦卒中時，機體自身會立即啟動抗氧化應(yīng)激機制進行自我保護。經(jīng)研究表明，機體啟動抗氧化應(yīng)激機制時內(nèi)源性Keapl-Nrf2/ARE信號通路會立即被激活，迅速對缺血的腦細(xì)胞給予保護，該機制是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要抗氧化應(yīng)激通道之一[2]。該信號通路是通過調(diào)節(jié)下游多種蛋白酶體和Ⅱ相解毒酶來對抗機體氧化應(yīng)激損傷、炎癥損傷以及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護作用。下面將初步闡述Keapl-Nrf2/ARE信號通路在糖尿病腦缺血性中的神經(jīng)保護作用機制。

l Keapl-Nrf2/ARE信號通路的分子結(jié)構(gòu)

1.1 Keap1的結(jié)構(gòu) Keap1蛋白在19P13.2位點上，是錨定于細(xì)胞胞漿肌動蛋白骨架上的多肽，其包含有624個氨基酸。Keap1蛋白由5個不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)域分別為C端結(jié)構(gòu)域(CTR)、N端結(jié)構(gòu)域(NTR)、BTB區(qū)、干預(yù)區(qū)(IVR)、以及雙甘氨酸重復(fù)區(qū)(DGR)。其中最重要的是雙甘氨酸重復(fù)區(qū)(DGR)，為Keap1蛋白和Nrf2蛋白的相結(jié)合位點。干預(yù)區(qū)(IVR)含有大量半胱氨酸是親電子類化合物和氧化劑反應(yīng)的重點區(qū)域，也是Keap1蛋白的重要功能調(diào)節(jié)區(qū)域[3]。BTB區(qū)域與形成同源二聚體有關(guān)，也與Nrf2-Keap1結(jié)合力相關(guān)[4]。Keap1是富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)與Nrf2特定結(jié)合后對Nrf2因子起負(fù)相調(diào)節(jié)作用[5]。

1.2 Nrf2的結(jié)構(gòu) Nrf2屬于cap-ncollar(CNC)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，1994年由Moi等[6]發(fā)現(xiàn)。最近發(fā)現(xiàn)的Nrf2蛋白包含有7個結(jié)構(gòu)域Neh (Nrf2-ECH homology)，分別命名為Nehl-Neh7[7]。其中Nehl區(qū)域內(nèi)包含有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)bZip(basic leucime zipper)，與核內(nèi)的小Maf蛋白(Maf proteins)形成同源或異源二聚體，可以被Nrf2因子識別，便于結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)，從而啟動相應(yīng)的目標(biāo)基因進行轉(zhuǎn)錄[8]。Neh2區(qū)域是Nrf2中最為重要的區(qū)域之一，在Neh2區(qū)域內(nèi)含有兩個結(jié)合位點，分別為ETGE基序和DLG基序，其可以結(jié)合胞漿蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein-1)。其中Neh3、Neh4、Neh5區(qū)域可參與下游基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)Nrf2蛋白與Keap1蛋白解離進入細(xì)胞核內(nèi)后，需要多種輔助蛋白、轉(zhuǎn)錄激活劑等物質(zhì)與Neh4、Neh5兩個結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)位點結(jié)合，方可啟動轉(zhuǎn)錄。Neh6結(jié)構(gòu)域由二個不同的模序組成，即DSGIS模序和DSAPGS模序，也參與調(diào)控Nrf2因子的穩(wěn)定性。當(dāng)前還發(fā)現(xiàn)Nrf2有第七個區(qū)域，可特異性地與維甲酸X受體α(retinoid X receptor alpha，RXRα)相結(jié)合從而下調(diào)Nrf2-ARE信號通路[7]。

1.3 ARE的結(jié)構(gòu) ARE作為細(xì)胞核內(nèi)最重要的抗氧化反應(yīng)元件，實質(zhì)為一段有特異性序列的DNA片段[9]。該特異性序列的DNA片段啟動序列之中含有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素氧化酶(HO)-1、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[NAD (P)H]、醌氧化還原酶1(NQO1)、谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)、過氧化氫酶(CAT)等Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶，該序列還可以被多種親電子化合物激活。當(dāng)Nrf2與ARE在細(xì)胞核內(nèi)相結(jié)合后立即激活Ⅱ相解毒酶的活性并啟動抗氧化酶基因的表達[10]。

2 Keapl、Nrf2和ARE的耦聯(lián)

當(dāng)機體受到損傷時會啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生大量活性氧(ROS)等物質(zhì)，其中活性氧可損傷細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的正常生理生化功能，為許多種疾病發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)[11]。生理狀態(tài)下機體均有一整套完整復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答體系，若暴露于親電子和(或)活性氧狀態(tài)下時，能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激系統(tǒng)應(yīng)答，生成一些保護性蛋白，以緩解機體所受的損害。Nrf2(NF-E2-related factor2)因子在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中充當(dāng)重要的角色，并受到Keap1蛋白調(diào)控，在生理狀態(tài)下Nrf2和Keap1蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，且不斷的泛素化降解，保持最低表達量，呈現(xiàn)動態(tài)平衡狀態(tài)，無轉(zhuǎn)錄活性[12]。當(dāng)機體受損發(fā)生氧化應(yīng)激時，在親電子類物質(zhì)或活性氧(ROS)的作用下可使Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，迫使Nrf2同Keap1解離并活化Nrf2因子。隨后活化的Nrf2因子便進入細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)結(jié)合，并上調(diào)Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白酶、泛素酶等多種蛋白酶體的基因表達水平[13]。

3 Keap1-Nrf2/ARE神經(jīng)調(diào)節(jié)作用

通過實驗已證明Nrf2因子是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要因子之一。該因子是通過調(diào)節(jié)泛素酶、抗氧化蛋白等多種蛋白酶體和Ⅱ相解毒酶的基因表達，從而上調(diào)谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化物的表達水平，其本質(zhì)特征是清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基等細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)，從而達到維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保護細(xì)胞作用[14]。

Nrf2因子在神經(jīng)系統(tǒng)中主要通過調(diào)節(jié)下游的血紅素加氧酶1(HO-1)和GSH保護神經(jīng)細(xì)胞免受氧化活性等物質(zhì)(如：ROS和RNS及有害物質(zhì)、致癌物質(zhì)、藥物代謝活化產(chǎn)物等)的侵害[15]。其中的血紅素加氧酶1 (HO-1)在超表達小鼠神經(jīng)對谷氨酸毒性實驗中表現(xiàn)有更好的耐受力，神經(jīng)元存活率較正常小鼠明顯提高，該研究充分證明HO-1參與有效的神經(jīng)保護作用。HO-1保護神經(jīng)元機制可能是[16]：一、清除有毒的游離血紅素，把血紅素降解為膽紅素、膽綠素，鐵離子、CO等無毒性物質(zhì)，且可通過多種途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。二、可上調(diào)細(xì)胞黏附分子促進白細(xì)胞聚集和粘附從而保護細(xì)胞受損。GSH參與神經(jīng)保護作用機制[17]：(1)GSH在神經(jīng)元細(xì)胞外間隙能與多種氧自由基反應(yīng)，阻止氧自由基進入細(xì)胞內(nèi)，形成保護神經(jīng)元細(xì)胞的防線；(2)GSH是目前唯一肯定能清除氧自由基的物質(zhì)；(3)體內(nèi)GSH在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)作用下與很多外源性有害物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，達到解毒目的；(4)GSH可儲存半胱氨酸，半胱氨酸為有毒性物質(zhì)，與谷胱甘肽結(jié)合后變?yōu)闊o毒性的物質(zhì)。GSH在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)神經(jīng)作用，也有充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)的作用。

4 Keap1-Nrf2/ARE與腦缺血

大腦神經(jīng)元細(xì)胞對缺血缺氧非常敏感，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)缺血缺氧時機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷、興奮性毒性、炎癥反應(yīng)、以及線粒體功能障礙等病理生理過程，上述過程均參與腦缺血缺氧的發(fā)生發(fā)展[18]。在大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)后再灌注試驗中顯示[14]：阻斷大腦中動脈2 h后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2因子表達開始增加，在24～48 h達到頂峰，其下游的抗氧化蛋白物質(zhì)GSH和HO-1在24～72 h梗死區(qū)域表達顯著升高。在實驗大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)，可減少缺血后的梗死面積，可說明Nrf2因子在腦缺血抗氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)中對缺血缺氧的腦細(xì)胞起到保護作用。在很多實驗中表明活化Keap1-Nrf2信號通路可以清除活性氧(ROS)，對腦缺血后神經(jīng)元細(xì)胞具有保護作用[19-20]。

大腦神經(jīng)元細(xì)胞通過線粒體將葡萄糖和氧轉(zhuǎn)化為能量和水的同時也產(chǎn)生大量的ROS，因腦組織中含不飽和脂肪酸較多，單位體積耗氧量較高，脂質(zhì)過氧化物多，同時抗氧化防御機制差，最終導(dǎo)致腦組織細(xì)胞易受到氧化應(yīng)激損傷[21]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)永久性腦缺血實驗小鼠模型中，缺血后立即暴露于250PPmco18n可使梗死面積明顯減少，Nrf2因子增加，同時HO-1表達量增加，但在Nrf2基因敲除后小鼠實驗中這種作用消失[4]。在大鼠永久性腦局部缺血試驗中，大鼠大腦中的Nrf2和mRNA表達量呈時間依賴性增加，在3 h后開始增加，一般24 h達到最高峰、隨后逐漸下降，下降可能與Keap1激活了下游Nrf2因子的降解相關(guān)[22]。

5 Keap1-Nrf2/ARE信號通路與糖尿病

通過大量活體動物實驗證實激活Keap1-Nrf2/ ARE信號通路可明確減少ROS等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，并改善由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)出現(xiàn)的胰島素抵抗，可調(diào)節(jié)糖尿病高血糖因素所致的組織細(xì)胞功能紊亂。同時該通路在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、保護胰島β細(xì)胞作用[22]。日本學(xué)者Akira Uruno等研究表明Keap1-Nrf2系統(tǒng)能阻止糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程[23]。在Keap1-Nrf2系統(tǒng)中內(nèi)源性性氧化物質(zhì)過高表達是機體防御糖尿病引起氧化應(yīng)激(OS)β細(xì)胞受損的機制，同時過量的ROS可能促進糖尿病及心腦血管等疾病發(fā)生發(fā)展[24]。

糖尿病患者在高血糖狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)糖的氧化增加，并且線粒體可產(chǎn)生過多超氧化物均可引起組織細(xì)胞損傷。高血糖狀態(tài)下氧化應(yīng)激是通過激活氧化應(yīng)激相關(guān)通路而導(dǎo)致胰島素抵抗，同時也激活抗氧化應(yīng)激通路，從而減輕糖尿病高血糖引起氧化應(yīng)激損傷，改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗[25-26]。Shah等[22]研究表明，若Keap1-Nrf2/ARE信號通路失去活性，則出現(xiàn)細(xì)胞功能失調(diào)、胰島素抵抗、血管活性物質(zhì)生成紊亂。胰島素與胰島素受體結(jié)合作用是通過胰島素受體底物絡(luò)氨酸磷酸化而體現(xiàn)其作用的?，F(xiàn)已證實葡萄糖氧化酶(GO)在處理肝細(xì)胞內(nèi)葡萄糖時可生成大量ROS，加重細(xì)胞內(nèi)氧化損傷并誘導(dǎo)出現(xiàn)胰島素抵抗[27]。既往研究證實姜黃素能誘導(dǎo)Nrf2因子在胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，可明顯減少ROS生成，從而減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胰島素抵抗。以上實驗研究均提示Keap1-Nrf2/ARE信號通路激活有抗氧化應(yīng)激的作用，可改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞胰島素抵抗作用[28-29]。

6 展 望

綜上所述，由Keap1-Nrf2/ARE信號通路介導(dǎo)的Nrf2因子等抗氧化蛋白因子和Ⅱ相解毒酶轉(zhuǎn)錄是當(dāng)前最為重要的抗氧化應(yīng)激機制之一。若能發(fā)現(xiàn)一種透過血腦屏障較好且能適度激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路的藥物，那將很大程度上減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)元細(xì)胞損害，為治療該類疾病提供新的方向。該藥物將上調(diào)Ⅱ相解毒酶及抗氧化反應(yīng)機制調(diào)控能力，從而提高機體抗氧化能力，保護由糖尿病引起腦缺血受損腦細(xì)胞，那將會減少糖尿病腦缺血的致殘率和致死率。目前該信號通路的調(diào)節(jié)多停留在動物實驗階段，尚未應(yīng)用于臨床治療之中。隨著對Keap1-Nrf2/ARE信號通路不斷深入的研究，未來對糖尿病腦缺血氧化應(yīng)激損傷大腦神經(jīng)細(xì)胞元治療領(lǐng)域有很大的促進作用。

[1]Bruno A.Management of hyperglycemia during acute stroke[J].Curr Cardiol Rep,2009,11(1):36-41.

[2] Schaap MC,Guimaraes AM,Wilderspin AF,et al.Protocol for a steady-state FRET assay in cancer chemoprevention[J].Methods Mol Biol,2016,1379(1):165-179.

[3]Ogura T,Tong KI,Mio K,et al.Keap1 is a forked-stem dimer structure with two large spheres enclosing the intervening,double glycine repeat,and C-terminal domains[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010, 107(7):2842-2847.

[4] Tu J,Zhang X,Zhu Y,et al.Cell-permeable peptide targeting the Nrf2-Keap1 interaction:a potential novel therapy for global cerebral ischemia[J].Neurosci,2015,35(44):14727-14739.

[5] Magesh S,Chen Y,Hu L.Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents[J].Med Res Rev,2012,32(4):687-726.

[6]Moi P,Chan K,Asunis I,et al.Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2),a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region[J].Proc NatlAcad Sci USA,1994,91(21):9926-9930.

[7]Wang H,Liu K,Geng M,et al.RXRalpha inhibits the NRF2-ARE signaling pathway through a direct interaction with the Neh7 domain of NRF2[J].Cancer Res,2013,73(10):3097-3108.

[8]Takagi Y,Kobayashi M,Li L,et al.MafT,a new member of the small Maf protein family in zebrafish[J].Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(1):62-69.

[9]Satoh T,McKercher SR,Lipton SA.Nrf2/ARE-mediated antioxidant actions of pro-electrophilic drugs[J].Free Radic Biol Med,2013,65 (1):645-657.

[10]宋媛.Keap1-Nrf2-ARE信號通路與2型糖尿病氧化應(yīng)激相關(guān)性研究進展[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(10):2878-2879.

[11]Lee JS,Surh YJ.Nrf2 as a novel molecular target for chemoprevention[J].Cancer Lett,2005,224(2):171-184.

[12]LauA,Villeneuve NF,Sun Z,et al.Dual roles of Nrf2 in cancer[J]. Pharmacol Res,2008,58(5-6):262-270.

[13]Kensler TW,Wakabayashi N,Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2007,47(1):89-116.

[14]Tanaka N,Ikeda Y,Ohta Y,et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2011,1370(1):246-253.

[15]Schipper HM,Song W,Zukor H,et al.Heme oxygenase-1 and neurodegeneration:expanding frontiers of engagement[J].Neurochem, 2009,110(2):469-485.

[16]Yu M,Li H,Liu Q,et al.Nuclear factor p65 interacts with Keap1 to repress the Nrf2-ARE pathway[J].Cell Signal,2011,23(5):883-892.

[17]Johnson JA,Johnson DA,Kraft AD,et al.The Nrf2-ARE pathway: an indicator and modulator of oxidative stress in neurodegeneration [J].Ann N YAcad Sci,2008,1147(1):61-69.

[18]Vargas MR,Johnson JA.The Nrf2-ARE cytoprotective pathway in astrocytes[J].Expert Rev Mol Med,2009,11(1):e17.

[19]Baron JC.Perfusion thresholds in human cerebral ischemia:historical perspective and therapeutic implications[J].Cerebrovasc Dis, 2001,11 Suppl 1:2-8.

[20]Shih AY,Li P,Murphy TH.A small-molecule-inducible Nrf2-mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J].Neurosci,2005,25(44):10321-10335.

[21]Zhang F,Wang S,Zhang M,et al.Pharmacological induction of heme oxygenase-1 by a triterpenoid protects neurons against ischemic injury[J].Stroke,2012,43(5):1390-1397.

[22]Shah ZA,Li RC,Thimmulappa RK,et al.Role of reactive oxygen species in modulation of Nrf2 following ischemic reperfusion injury [J].Neuroscience,2007,147(1):53-59.

[23]Chen G,Fang Q,Zhang J,et al.Role of the Nrf2-ARE pathway in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J]. Neurosci Res,2011,89(4):515-523.

[24]Abdul-Ghani MA,Jani R,Chavez A,et al.Mitochondrial reactive oxygen species generation in obese non-diabetic and type 2 diabetic participants[J].Diabetologia,2009,52(4):574-582.

[25]Uruno A,Yagishita Y,Yamamoto M.The Keap1-Nrf2 system and diabetes mellitus[J].Arch Biochem Biophys,2015,566(1):76-84.

[26]Uruno A,Furusawa Y,Yagishita Y,et al.The Keap1-Nrf2 system prevents onset of diabetes mellitus[J].Mol Cell Biol,2013,33(15): 2996-3010.

[27]Vetere A,Choudhary A,Burns SM,et al.Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes[J].Nat Rev Drug Discov,2014,13(4): 278-289.

[28]Bonora E.Protection of pancreatic beta-cells:is it feasible[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2008,18(1):74-83.

[29]Saha PK,Reddy VT,Konopleva M,et al.The triterpenoid 2-cyano-3, 12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic-acid methyl ester has potent anti-diabetic effects in diet-induced diabetic mice and Lepr(db/db)mice [J].Biol Chem,2010,285(52):40581-40592.

R587.2

A

1003—6350（2016）24—4066—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.24.035

2016-04-09)

韓江全。E-mail:gdshangjq@163.com