木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性研究

楊雨婷　何貝軒　彭成　張雪　盧俊宇　熊亮　何育霖 曹治興

【摘要】目的：以斑馬魚胚胎為模型，研究木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性及心臟發(fā)育毒性的影響。方法：采用斑馬魚胚胎模型，將其暴露于含有不同濃度（50、25、12.5、6、3、1.5mg·L^-1）的木香及藏木香揮發(fā)油中培養(yǎng)96h，于24，48，72，96hpf觀察斑馬魚胚胎發(fā)育形態(tài)，畸形率，24hpf擺尾率，48hpf心率及各時間點的死亡率。結(jié)果：24hpf，藏木香揮發(fā)油和木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎毒性的LC50分別為12.71、44.88mg·L^-1； 96hpf藏木香揮發(fā)油和木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎毒性的LC50分別為7.11、17.18mg·L^-1。在6mg·L^-196hpf藏木香揮發(fā)油胚胎發(fā)育主要表現(xiàn)為脊柱側(cè)彎、心臟水腫、卵黃囊水腫；而相同濃度、相同劑量的木香揮發(fā)油則未監(jiān)測到該現(xiàn)象。12mg·L^-1藏木香揮發(fā)油可致斑馬魚擺尾次數(shù)和心率明顯下降（P<0.01），木香揮發(fā)油則無明顯影響（P>0.05）。結(jié)論：藏木香和木香揮發(fā)油對斑馬魚毒性大?。翰啬鞠銚]發(fā)油>木香揮發(fā)油。

【關鍵詞】藏木香揮發(fā)油；木香揮發(fā)油；斑馬魚；胚胎發(fā)育毒性

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0023-03

斑馬魚是鯉科短擔尼魚屬，原產(chǎn)于南亞，是一種常見的熱帶魚。目前的生命科學研究中，斑馬魚是三種主要模式脊椎動物之一，被世界廣泛關注，是公認的新興模式脊椎動物。斑馬魚個體小，能大規(guī)模繁殖；體外受精，胚胎發(fā)育透明，胚胎早期發(fā)育快，易于大量獲取實驗所需樣品。因其早期發(fā)育身體透明，易于對胚胎發(fā)育過程進行直接觀察，且對母體無傷害，故可用作毒性學評價模型[1]。

木香為菊科多年生草本植物木香Aucklandia lappa Decne.干燥根，主產(chǎn)于云南等地。木香主要含揮發(fā)油，其氣味芳香濃烈而特異，有行氣止痛之功效，被廣泛用于治療脾胃、大腸及肝膽氣滯證等[2]。臨床上木香被廣泛應用，為濕濁中阻嘔吐之要藥，可單用或配伍用于治療妊娠嘔吐。藏木香是一味民間藏藥，又名青木香，藏名“瑪奴”，為菊科植物藏木香Inula racemosa Hook.f. 的干燥根，其味辛、苦，性溫，具有調(diào)氣解郁、健脾和胃、止痛等功效，臨床上常用于治療胎動不安、胃腸功能紊亂等癥[3]。目前，木香及藏木香揮發(fā)油的安全性評價對比研究尚未見報道，故本課題采用斑馬魚模型，對木香及藏木香揮發(fā)油進行體內(nèi)胚胎發(fā)育的安全性比較實驗。

1 實驗與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 木香揮發(fā)油、藏木香揮發(fā)油（成都中醫(yī)藥大學藥物研究所，批號20150222），均以二甲基亞砜（DMSO）配成50mg·L^-1的濃縮液備用。

1.1.2 實驗動物 健康AB品系野生型斑馬魚，由四川大學生物治療國家重點實驗室饋贈。培育于成都中醫(yī)藥大學斑馬魚實驗室。

1.1.3 主要儀器與試劑 氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀等試劑（使用試劑均為分析純，廠家：成都市科龍化工試劑廠 批號：144-55-8）；二甲基亞砜（DMSO，SIGMA公司，批號：SZBE0170V），體視熒光顯微鏡（Leica 型號M165Flc）：斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號MGC-100）；斑馬魚胚胎繁殖培養(yǎng)液10% Hank′s液（13.7mmol/L NaCl，0.54mmol/L KCl，0.025mmol/L Na2HPO4，0.044mmol/L KH2PO4，1.3mmol/L CaCl2，1.0mmol/L MgSO4，0.42mmol/L NaHCO3）。

1.2 方法

1.2.1 胚胎收集 依照斑馬魚及相關實驗技術[4]中所述方式，傍晚，將正常成年斑馬魚雌∶雄=1∶1，放入產(chǎn)卵盒內(nèi)，用隔板分離。水溫控制在27.5℃～28.5℃，控制光周期為14∶10（即光照14h，黑暗10h），至次日早晨轉(zhuǎn)變?yōu)楣庹掌谂鋵Γ?h后吸去糞便等污物，用10% Hank′s液沖洗數(shù)次，選取發(fā)育正常的胚胎進行實驗。

1.2.2 給藥方法 將配置好的木香及藏木香揮發(fā)油的濃縮液加入新鮮10%Hank′s液中，按二倍梯度稀釋法，稀釋為6個濃度，即50、25、12、6、3、1.5mg·L^-1，于10hpf將斑馬魚胚胎暴露于藥液中，按20個/孔置于24孔板，每孔容積為1.5ml，以DMSO為溶劑對照，并設置空白對照，置于培養(yǎng)箱中孵化96h。

1.2.3 觀察指標 從10hpf起連續(xù)培養(yǎng)在對應濃度的對照組和藥液中，分別在24hpf、48hpf、72hpf、96hpf于顯微鏡下觀察記錄胚胎發(fā)育情況，統(tǒng)計藥物作用于斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的死亡率、畸形率、成活率和心率等指標，并以死亡率計算不同時間點的LC50。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件中的方差分析法檢驗各實驗組及對照組之間的差異，并采用兩兩配對多重比較的方法分析各組之間差異的統(tǒng)計學意義，檢驗水準a=0.05。

3 結(jié)果

3.1 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎死亡率的影響 以胚胎死亡為終點觀察指標，給予木香及藏木香揮發(fā)油不同濃度和不同暴露時間，結(jié)果，在48hpf內(nèi)，隨著暴露時間的延長，兩組斑馬魚胚胎死亡率均逐漸增加。其中，作用24h時，木香揮發(fā)油、藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎毒性的LC50及95%置信區(qū)間分別為 44.88（34.36～72.11）、12.71（9.42～17.23）mg·L^-1；作用48h時LC50的95%置信區(qū)間分別為17.18（14.52～21.56）、7.11（5.50～9.07）mg·L^-1。具體實驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩個藥物均對斑馬魚有胚胎發(fā)育毒性，其毒性為木香揮發(fā)油>藏木香揮發(fā)油。

3.2.2 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎存活率的影響 斑馬魚胚胎暴露于含有木香或藏木香揮發(fā)油12mg·L^-1的10% Hank′s液，10hpf～48hpf隨著藥物暴露時間的延長，斑馬魚胚胎的毒性逐漸增強，而在48～96hpf時間段內(nèi)，未見毒性蓄積效應。從表2可見，在相同作用時間和作用濃度下，毒性從小到大依次為木香揮發(fā)油>藏木香揮發(fā)油。

3.2.3 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育形態(tài)學的影響 分別于24hpf、96hpf在顯微鏡下觀察斑馬魚的形態(tài)發(fā)育，拍攝木香及藏木香揮發(fā)油組在12mg·L^-1和6mg·L^-1的胚胎發(fā)育情況（見圖1）。24hpf空白對照組已出膜為幼魚，正常發(fā)育； 24hpf 12mg·L^-1和6mg·L^-1木香揮法油組出現(xiàn)不同程度的脊柱側(cè)彎；對應濃度的藏木香揮發(fā)油組表現(xiàn)出心臟和卵黃囊腫大、脊柱側(cè)彎； 96hpf 空白對照組； 96hpf 木香揮發(fā)油組僅 12mg·L^-1脊柱稍微側(cè)彎，藏木香揮法油組表現(xiàn)出不同程度的心臟卵黃囊腫大、脊柱側(cè)彎。

3.2.4 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚擺尾次數(shù)的影響 斑馬魚胚胎發(fā)育至24h，其尾部會表現(xiàn)出強烈的抽動，當將其暴露于上述藥物時，由于發(fā)育異常而影響此擺尾活動。于24hpf，12mg·L^-1濃度下記錄1min內(nèi)斑馬魚幼魚的擺尾次數(shù)。結(jié)果顯示，，正常對照組胚胎擺尾次數(shù)為4.50次·min^-1，藏木香揮發(fā)油組1.13次·min^-1，有差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），木香揮發(fā)油3.91次·min^-1，與空白對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果詳見表2。

3.2.5 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率 與空白對照組比較，木香及藏木香揮發(fā)油在12 mg·L^-1時，48hpf，藏木香揮發(fā)油的畸形率高于木香揮發(fā)油組，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但在48h后，木香及藏木香揮發(fā)油的畸形率不變。結(jié)果見表4。

3.2.6 木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚心率的影響 48hpf，在顯微鏡下記錄30s內(nèi)斑馬魚心跳次數(shù)。選取最低毒性劑量12mg·L^-1記錄各組斑馬魚心率次數(shù)，比較藏木香揮法油和木香揮法油對斑馬魚心臟發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藏木香揮發(fā)油組和木香揮發(fā)油的斑馬魚心率明顯減慢。結(jié)果見表5。

4 討論

《日華子本草》記載木香有“治心腹一切氣，止瀉，霍亂，痢疾，安胎，健脾消食。療羸劣，膀胱冷痛，嘔逆反胃”之效；《西藏常用中草藥》記載藏木香有“健脾和胃、調(diào)氣解郁、止痛、安胎。治慢性胃炎、胃腸機能紊亂、肋間神經(jīng)痛、胸壁挫傷和岔氣作痛”的功效，近期研究表明，木香及藏木香均有不同程度的抗腫瘤作用，可作為臨床潛在的抗癌開發(fā)藥物[5-6]。 但對于藏木香和木香的基礎毒性研究報道甚少[7]，且傳統(tǒng)的動物毒性無法實時直觀地觀測到藥物對于胚胎發(fā)育的影響，也無法快速大量地統(tǒng)計藥物對于胚胎發(fā)育致畸的影響。故本實驗利用斑馬魚胚胎發(fā)育透明、對藥物作用敏感且能直接觀測到藥物對于斑馬魚胚胎發(fā)育作用的特性，探討木香及藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。實驗結(jié)果表明，24hpf擺尾次數(shù)，48hpf的心率、各時間點的存活率、畸形率及斑馬魚形態(tài)發(fā)育指標可看出，木香揮發(fā)油較藏木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性小，木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎的LC50亦明顯高于藏木香揮發(fā)油。由此可見，木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性較藏木香揮發(fā)油安全。提示臨床用藥時，有必要重視藏木香對胚胎發(fā)育的影響，建議孕婦和哺乳期的婦女慎用該藥物，也不應長期或大量給予嬰幼兒使用含有藏木香揮法油的藥物；木香雖較藏木香安全，但在所設定的劑量范圍內(nèi)，木香揮發(fā)油仍有致畸作用，故建議進一步采用多種模型確立其安全范圍，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

參考文獻

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（收稿日期：2015.09.28）