減味壽胎丸對復發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）小鼠蛻膜中樹突狀細胞（DCs）表達干預研究

方家　刁軍成　李林

【摘要】目的：研究減味壽胎丸對復發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）小鼠蛻膜中樹突狀細胞（DCs）表達干預。方法：建立成熟、完善的RSA小鼠蛻膜的DCs體外培養(yǎng)體系。檢測正常妊娠和RSA小鼠蛻膜中CD83+、CD1a的表達，以及CCLl7和CCL22的表達，探討DCs在母胎免疫耐受機制中的可能作用以及與URSA的關(guān)系。探討壽胎丸對RSA小鼠對蛻膜DCs表達的影響，從而探討中藥對DCs影響母胎免疫耐受的干預機制。結(jié)果：RSA小鼠的蛻膜中CD83+、CD1a；CCLl7和CCL22表達與正常妊娠組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；RSA小鼠的血清HCG和P值與正常妊娠組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：減味壽胎丸可以通過提升小鼠血清HCG、P值；降低CD83+的表達，提高CDla+的表達；增加母胎界面CCLl7、CCL22表達，從而起到多途徑防治RSA的目的。

【關(guān)鍵詞】減味壽胎丸；復發(fā)性自然流產(chǎn)；樹突狀細胞

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0012-02

自然流產(chǎn)指妊娠在28周以前終止、胎兒體重在1000g以下者，發(fā)生率15%～20%。如自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次或2次以上稱為復發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion RSA），發(fā)生率約1%[1]。妊娠是一種成功的同種異體移植現(xiàn)象，胎兒胎盤作為母體半同種異體移植物和妊娠免疫識別單位，其成功有賴于妊娠母體的免疫耐受，這種耐受一旦被破壞，則導致病理性妊娠，如流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等。RSA已知的病因有染色體異常、生殖器官畸形、內(nèi)分泌失調(diào)、感染、免疫、環(huán)境理化等。近代生殖免疫研究表明[2]，約50%～60%的RSA與免疫有關(guān)，RSA的免疫學病因日益受到重視。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性CBA/J小鼠，10周齡，體重20g，60只。雄性BALB/c小鼠，10周齡，體重20g，15只。雄性DBA/2小鼠，10周齡，體重20g，15只。由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號： No.44005900000741/ No.44005900000742。

1.1.2 藥品與試劑 ①醇提+醇提后水提方法所提取的減味壽胎丸復方（菟絲子400g、桑寄生300g、續(xù)斷300g分別制備復方醇提物和復方水提物，將兩者合并既得減味壽胎丸復方總提物樣品。②地屈孕酮片（達芙通）：荷蘭Abbott Biologicals B.V，規(guī)格：10mgX20片 批號：344033。③小鼠可溶性CD1a、CD83、CD86（B7-2/sCD86）ELISA Kit.④小鼠胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC/CCL2、CCL17、CCL22）ELISA。

1.1.3 實驗儀器 全自動血細胞分析儀（XE-5000 日本Sysmex公司）、放免Y測量儀（SN-695B 上海日環(huán)儀器廠）、酶標儀（Bio-TekELX-800奧林巴斯）、生物顯微（CX21BIM-SET奧林巴斯）、超低溫冰箱、電子天平、電熱恒溫水浴箱 、離心沉淀機、50ml燒杯、特制塑料筒（內(nèi)徑約3Cm），恒溫照明燈、眼科鑷、縫針、絲線、持針器、注射器、灌胃針頭、解剖臺、燒杯、試管、小動脈插管、小血管夾、微量加樣器、膠頭滴管等。

1.2 方法

1.2.1 RSA小鼠造模方法 將雌性CBA/J小鼠（英文名：CBA/J mouse；分類地位：脊椎動物門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、鼴鼠屬、小鼠種、CBA/J小鼠品系；具有可提供研究的活體動物；飼養(yǎng)條件：屏障系統(tǒng)；微生物學等級：SPF級；類別：近交系；品系描述：CBA/J小鼠是CBA/J品系小鼠的其中一個亞系，其攜帶有Pde6brd1突變，該突變基因可使小鼠幼年時就失明。CBA/J一般用于研究肉芽腫型實驗性自動免疫性甲狀腺炎。對飲食誘導的動脈粥樣硬化有很好的的抵抗性，在小鼠年老時會逐步出現(xiàn)微弱的聽力損失情況，腎小管間質(zhì)病變概率較高。雌鼠可能有習慣性流產(chǎn)。應用領(lǐng)域為肉芽腫型實驗性自動免疫性甲狀腺炎 視網(wǎng)膜退化變性 習慣性流產(chǎn) 聽力損失）分別與雄性DBA/2（1909年C.C. Little從因毛色而分離出來的品系培育而成，是最早的一個近交系小鼠，常用于腫瘤學、遺傳學和免疫學等方面的研究）和BALB/c小鼠（BALB/c 是白變種實驗室老鼠，與眾多常用亞系一樣，起源于小家鼠Mus musculus。從1920年它們在紐約誕生至今，BALB/c小鼠在全球研究機構(gòu)繁衍了超過200代，廣泛用于免疫學、生理學的動物實驗。）合籠交配[1]，檢出陰栓者計為妊娠第1天，分別建立反復自然流產(chǎn)模型30只與正常妊娠模型10只。

1.2.2 分組及給藥方案 按妊娠順序隨機分為RSA模型組（A）、RSA達芙通組（B）、RSA減味壽胎丸組（C）、正常妊娠模型組（D），自妊娠第1天開始灌胃，分早晚兩次給藥，直至孕14d取材。

1.2.3 觀察指標 ①一般情況形態(tài)、毛色、活動、納食、大便等。②解剖后觀察子宮口及子宮形態(tài)、顏色、官腔內(nèi)變化；正常胚胎數(shù)、流產(chǎn)胚胎數(shù)。③血清HCG、P值。④蛻膜中CD83+、CD1a值。⑤蛻膜中CCLl7、CCL22。

1.2.4統(tǒng)計學方法 將實驗所得的數(shù)據(jù)輸入計算機，建立Excel數(shù)據(jù)庫，進行數(shù)據(jù)管理，應用SPSS 21.0和SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料：若數(shù)據(jù)符合方差齊，正態(tài)分布，多組獨立樣本采用方差分析，組間兩兩比較使用LSD檢驗； 兩獨立樣本比較采用t檢驗，組內(nèi)治療前后自身比較采用配對t檢驗；不符合正態(tài)性分布的多組樣本則采用多組數(shù)據(jù)的秩和檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗；不符合正態(tài)分布的兩獨立樣本比較，采用Wilcoxon秩和檢驗，組內(nèi)治療前后自身比較采用配對秩和檢驗（Wilcoxon法）。

2 結(jié)果

2.1 RSA小鼠與正常妊娠小鼠一般狀態(tài)的比較 RSA小鼠與正常小鼠一般狀態(tài)良好、毛色光滑、反應靈活、體重呈穩(wěn)步增長、食欲量好、大便正常。給藥期間無不良反應。

解剖后肉眼見正常妊娠小鼠子宮為光潔粉紅色，呈結(jié)節(jié)狀膨大，發(fā)育良好，胚胎之間界限清晰，周圍血供豐富，解剖后見胚胎完好；RSA小鼠子宮膨大的結(jié)節(jié)小于正常妊娠組，胚胎數(shù)目無明顯差異；胚胎有明顯瘀血痕跡。

第1天、第5天和第10天的各組小鼠解剖后各組子宮重量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；各組小鼠正常胚胎數(shù)和流產(chǎn)胚胎數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 減味壽胎丸對RSA小鼠血清HCG、P的影響 表1結(jié)果顯示，B組和C組小鼠的血清HCG值與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組小鼠的血清HCG值與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；B組和C組小鼠的血清HCG值與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；B組和C組小鼠的血清HCG值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

B組和C組小鼠的血清P值與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組小鼠的血清P值與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；B組和C組小鼠的血清P值與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；B組和C組小鼠的血清P值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 減味壽胎丸對RSA小鼠的蛻膜中CD83+、CD1a的影響 表2結(jié)果顯示，B組和C組小鼠的CD83+、CD1a表達與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組小鼠的CD83+、CD1a表達與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；B組和C組小鼠的CD83+、CD1a表達與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；B組和C組小鼠的CD83+、CD1a表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4 減味壽胎丸對RSA小鼠母胎界面的蛻膜中CCLl7、CCL22的影響 表3結(jié)果顯示，B組和C組小鼠的CCLl7、CCL22與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組小鼠的CCLl7、CCL22與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；B組和C組小鼠的CCLl7、CCL22與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； B組和C組小鼠的CCLl7、CCL22比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

壽胎丸源于《醫(yī)學衷中參西錄》，由菟絲子、桑寄生、川斷、阿膠四味中藥組成，主治滑胎。臨床研究證實[2]壽胎丸有增強免疫應答、提高封閉抗體效應的作用等。此方已在多年的實驗研究下從多層面如PR、ER、Th1、Th2、IL-2、IL-10、TGF-β1等指標已證實了治療反復流產(chǎn)療效性及在免疫學方面的貢獻。方中重用菟絲子補腎益精，壯胎元以安胎，以為君藥。桑寄生養(yǎng)血強筋骨，以使胎氣強壯而安胎；川斷也是補腎要藥，能夠固沖安胎；以上共為臣藥。上述三味同用，能使腎氣旺盛，精血充沛，自能固胎。再兼阿膠補血、止血，使血脈安伏以養(yǎng)胎安胎，是為臣使之藥。綜合全方，共奏補腎養(yǎng)血、固攝安胎之效，大量臨床報道本方治療反復自然流產(chǎn)療效顯著。菟絲子為補腎安胎代表方壽胎丸的君藥，黃酮類化合物為菟絲子主要化學成分。菟絲子總黃酮[2]可降低流產(chǎn)模型的流產(chǎn)率，逆轉(zhuǎn)流產(chǎn)胎盤、蛻膜結(jié)構(gòu)的病理改變，同時能提高孕激素水平，促進蛻膜孕激素受體的表達，調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子平衡的作用，改善蛻膜、滋養(yǎng)細胞凋亡和增殖狀態(tài)，提示菟絲子總黃酮可能是菟絲子補腎安胎的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

為深入研究壽胎丸防止自然流產(chǎn)的藥效學物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制，博士導師團隊以腎虛型黃體功能抑制病證結(jié)合動物流產(chǎn)模型為載體，通過觀察不同提取方法壽胎丸復方對模型動物影響的藥效試驗確立了壽胎丸復方的提取方法，研究結(jié)果表明[2]，醇提+醇提后水提方法所提取的壽胎丸復方補腎安胎效果最佳。并采用數(shù)學方法均勻設(shè)計與計算機結(jié)合技術(shù)，將均勻設(shè)計改良應用于壽胎丸的研究，定性的得到了壽胎丸的優(yōu)選方及其藥物組成原理和配伍關(guān)系，明確了該方最佳藥效組合及配伍劑量（優(yōu)選方），并經(jīng)藥效實驗證實去阿膠的減味壽胎丸具有與壽胎丸基本相同的安胎效果。

長期以來，由于缺乏特異性的樹突狀細胞（Dendritic cells DCs）鑒定方法，給人們研究DCs造成了一定的困難，以致很長一段時間內(nèi)研究者把DCs誤以為是巨噬細胞。研究發(fā)現(xiàn)，DCs的主要特異性標志物是CD83和CD1a，本研究選取公認的CD83、 CDla作為成熟、未成熟DCs的標記物，進行ELISA檢測實驗，觀察RSA小鼠蛻膜組織中CD83+、CDla+DCs的分布、數(shù)量等情況。探討DCS的功能狀態(tài)與RSA的關(guān)系，為揭示RSA的發(fā)病機制、防治RSA提供新的思路。已有實驗表明[3]人體正常妊娠后DC表達CCLl7、CCL22增強，DC可能通過高表達CCLl7、CCL22對CD4+CD25+T細胞趨化作用增強，從而在母胎界面的免疫耐受中發(fā)揮調(diào)控作用。其表達CCLl7、CCL22的能力降低可能與RSA流產(chǎn)的發(fā)病有關(guān)。我們以此為切入點，展開了CCL17、CCL22在母-胎界面生物學功能的研究，以闡明母胎界面蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜免疫活性細胞間相互對話的分子和機制，進而揭示趨化因子在母-胎界面免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，減味壽胎丸可以通過提升小鼠血清HCG、P值；降低CD83+的表達，提高CDla+的表達；增加母胎界面CCLl7、CCL22表達，從而起到多途徑防治RSA的目的。

參考文獻

[1]尤昭玲，何冬梅，賴毛華.正常妊娠與反復自然流產(chǎn)小鼠母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白表達的差異.中國婦幼保健[J].2008.23：5192.

[2]郜潔.壽胎丸的藥物組成及其補腎安胎的藥效學研究.博士論文[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，45，2009.

[3]Compp C， Thurnau G R， et al. Functional and immunologic Protein S levels Are decreased during Pregnancy Blood[J]. 2010， 68（18）： 881-555.

（收稿日期：2015.11.06）