阿哌沙班片溶出度測(cè)定方法研究

郭兆元， 聶忠莉， 胡一冰， 曾 吉， 王曉玲，葉 丁， 張 勇， 蕭茂玲， 郭 瑞

(1.成都大學(xué) 四川抗生素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司， 四川 成都 610041)

阿哌沙班片溶出度測(cè)定方法研究

郭兆元1， 聶忠莉2， 胡一冰2， 曾 吉2， 王曉玲3，葉 丁3， 張 勇3， 蕭茂玲3， 郭 瑞3

(1.成都大學(xué) 四川抗生素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司， 四川 成都 610041)

建立了以高效液相色填充譜法測(cè)定阿哌沙班片溶出度的測(cè)定方法，采用0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液900 mL為溶出介質(zhì)，溫度為37 ℃±0.5 ℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溶出介質(zhì)經(jīng)脫氣處理，取樣時(shí)間為30 min.結(jié)果顯示，6批供試品及對(duì)照藥品30 min的溶出度均在80%以上，均符合規(guī)定.方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于測(cè)定阿哌沙班片的溶出度.

阿哌沙班片；溶出度；高效液相色譜法

0 引 言

阿哌沙班是一類新型的強(qiáng)效可逆性凝血因子抑制劑.據(jù)報(bào)道，阿哌沙班已完成預(yù)防全髖關(guān)節(jié)和全膝關(guān)節(jié)成形術(shù)后靜脈血栓栓塞(VTE)的相關(guān)臨床試驗(yàn)，并于2011年5月得到歐盟對(duì)其用于此適應(yīng)癥的上市許可[1-2].目前，阿哌沙班被廣泛用于針對(duì)術(shù)后靜脈血栓栓塞(VTE)的治療[3]、預(yù)防重病住院患者出現(xiàn)VTE與房顫患者[4]，以及其他血栓栓塞事件的Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究[5-6].藥品溶出度試驗(yàn)作為一種模擬固體口服制劑在胃腸道中崩解和溶出的體外試驗(yàn)方法，常被作為一種體外替代方法為體內(nèi)生物等效性研究和體內(nèi)外相關(guān)性研究提供信息和指導(dǎo)[7]。此外，溶出度試驗(yàn)還被作為小分子藥物的質(zhì)量控制手段，用來(lái)保證產(chǎn)品批間的一致性以及后續(xù)的上市產(chǎn)品與臨床實(shí)驗(yàn)樣品的一致性.貯藏過(guò)程中，產(chǎn)品溶解速率的變化體現(xiàn)出固體口服制劑穩(wěn)定性的差異，因此，溶出度試驗(yàn)在藥物固體口服制劑的研發(fā)過(guò)程中具有重要的作用[8].本研究依據(jù)《化學(xué)藥物制劑研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過(guò)程技術(shù)指導(dǎo)原則》以及《中國(guó)藥典》2015年版四部通則中有關(guān)的指導(dǎo)原則對(duì)阿哌沙班片溶出度方法進(jìn)行了探討，通過(guò)對(duì)阿哌沙班片溶出度方法學(xué)驗(yàn)證，證明本方法適合阿哌沙班片的溶出度測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠.

1 儀器與試藥

1.1 試 藥

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括：阿哌沙班片(供試品，批號(hào)，140101、140102、140103、140201、140202、140203)，由成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司提供，阿哌沙班片(對(duì)照品，批號(hào)，AP130901)；十二烷基磺酸鈉(AR)、磷酸鈉(AR)、磷酸(AR)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(AR)、純化水、醋酸(AR)、鹽酸(AR)、乙腈(AR)、三乙胺(AR).

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：ZRS-8G型智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠)；ACS-30-JC11型電子秤(廣東香山衡器集團(tuán)有限公司)；MS分析天平(梅特勒—托利多)；Agilent-1200型液相色譜儀(山東金普分析儀器有限公司)；PHS-3C型PH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).

2 方 法

2.1 阿哌沙班片溶出度含量測(cè)定方法學(xué)研究

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)掃描及空白干擾試驗(yàn).

1)輔料空白溶液的制備.取空白輔料約60 mg(相當(dāng)于1片的輔料)，置100 mL量瓶中，加4 mL乙腈，充分振搖使?jié)櫇瘢曁幚?5 min，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得.同法制得在0.05%CTAB-水、0.5%CTAB-pH 4.5的醋酸緩沖液、0.5%CTAB-0.1 mol/L的鹽酸溶液中的空白輔料溶液.

2)對(duì)照品溶液的制備.精密稱取阿哌沙班對(duì)照品約11 mg，置于100 mL量瓶中，加4 mL乙腈溶解后，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得.同法制得在0.05%CTAB-水、0.5%CTAB-pH 4.5的醋酸緩沖液、0.5%CTAB-0.1 mol/L的鹽酸溶液中的對(duì)照品溶液.

3)供試品溶液的制備.精密稱取阿哌沙班片粉末約70 mg(相當(dāng)于阿哌沙班10 mg)，置于100 mL量瓶中，加4 mL乙腈，充分振搖使?jié)櫇?，超聲處?5 min，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得.同法制得在0.05%CTAB-水、0.5%CTAB-pH 4.5的醋酸緩沖液、0.5%CTAB-0.1 mol/L的鹽酸溶液中的供試品溶液.

分別取上述溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描.結(jié)果表明，4種溶出介質(zhì)中阿哌沙班對(duì)照品和供試藥品均在270±5 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，輔料在此范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收峰，表明輔料不干擾該法測(cè)定.因此，將270 nm作為阿哌沙班溶出度測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng).

2.1.2 色譜條件.

阿哌沙班溶出度檢測(cè)的色譜條件為：除檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm外，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱溫為35 ℃，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)pH值至3.0)—乙腈(45∶55)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min；理論板數(shù)按阿哌沙班主峰計(jì)算不低于5 000.

2.1.3 線性關(guān)系考察.

取阿哌沙班對(duì)照品約11 mg，加4 mL乙腈溶解后，用0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋并制成每1 mL含阿哌沙班0.11 mg的溶液，作為儲(chǔ)備液.分別精密量取儲(chǔ)備液適量，加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋成表1所示濃度，搖勻，分別進(jìn)樣測(cè)定.以對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理.計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1及圖1.

表1 溶出度線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 阿哌沙班片溶出度線性圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿哌沙班在0.61 μg/mL～19.90 μg/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度呈良好線性關(guān)系.

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取線性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下5號(hào)樣品(10.85 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿哌沙班樣品溶出度測(cè)定重復(fù)性良好.

2.1.5 穩(wěn)定性考察.

取線性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下5號(hào)樣品(10.85 μg/mL)，室溫放置，分別于0、30、60、90、120、180、240、360 min取樣，測(cè)定，并計(jì)算RSD(%)值，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿哌沙班樣品在360 min內(nèi)保持穩(wěn)定.

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn).

取阿哌沙班對(duì)照品11 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加少量乙腈使其溶解，用0.1%CTAB-pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液.分別精密量取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL溶液置于100 mL量瓶中，再按處方比例加入空白輔料，模擬溶出條件使其溶解，用0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，制得供試品溶液.另取上述儲(chǔ)備液適量，用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋并制成每1 mL含阿哌沙班11 μg/mL的溶液，搖勻，制得對(duì)照品溶液.

取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 溶出度測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿哌沙班樣品回收率良好，方法可靠.

2.2 溶出度實(shí)驗(yàn)方法研究

2.2.1 溶出介質(zhì)確定.

取供試藥品6片，按照溶出度測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2015年版四部 通則0931)，采用槳法，以900 mL 0.05%CTAB-水、0.5%CTAB-pH 4.5的醋酸緩沖液、0.5%CTAB-0.1 mol/L的鹽酸溶液、0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸緩沖液作為溶出介質(zhì)，溫度為37 ℃±0.5 ℃，溶出介質(zhì)均經(jīng)脫氣處理，轉(zhuǎn)速為75 r/min，分別在5、10、15、30、45、60、90、120 min時(shí)取樣10 mL，并補(bǔ)加等溫等體積的溶出介質(zhì)10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液.另取阿哌沙班對(duì)照品適量，用相應(yīng)的溶出介質(zhì)溶解并稀釋制成每1 mL中含阿哌沙班11 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液.除檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm外，按照含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，取上述種溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜，計(jì)算出每片不同時(shí)間的累計(jì)百分溶出度，計(jì)算公式為，

測(cè)定結(jié)果如表5及圖2所示.

表5 供試品在不同溶出介質(zhì)中的累積溶出度測(cè)定結(jié)果(n=6)

圖2 不同溶出介質(zhì)的溶出曲線比較圖

由上述結(jié)果可知，本品在0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中的溶出最快.因此，選擇0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液作為本品的溶出介質(zhì).

2.2.2 溶出體積選擇.

取阿哌沙班原料藥約10 mg置于250 mL量瓶中加0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液100 mL振搖5 min，結(jié)果未完全溶解，再加入0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液50 mL，振搖5 min，完全溶解，即10 mg阿哌沙班能完全溶解于150 mL 0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，符合漏槽條件的溶液體積至少應(yīng)為450 mL.因此，將溶出介質(zhì)的體積暫定為900 mL.

2.2.3 溶出轉(zhuǎn)速選擇.

取供試藥品6片，按照溶出度測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2015年版四部 通則0931)，以900 mL的0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速分別為50 r/min和75 r/min，溫度為37 ℃±0.5 ℃，溶出介質(zhì)均經(jīng)脫氣處理，分別在5、10、15、30、45、60 min時(shí)取樣10 mL，并補(bǔ)加等溫等體積的溶出介質(zhì)10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液.另取阿哌沙班對(duì)照品適量，用相應(yīng)的溶出介質(zhì)溶解，并制成每1 mL含阿哌沙班15 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液.除檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm外，按照含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，取上述種溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜，計(jì)算出每片不同時(shí)間的累計(jì)百分溶出率.

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，溶出曲線比較如圖3所示.

圖3 不同轉(zhuǎn)速的溶出度曲線比較圖

由上述結(jié)果可知，供試藥品在相同的取樣時(shí)間點(diǎn)，75 r/min的溶出速率總體稍高于50 r/min的溶出速率，故選擇轉(zhuǎn)速為75 r/min.

2.2.4 取樣時(shí)間選擇.

對(duì)于普通制劑，在大多數(shù)情況下，藥品標(biāo)準(zhǔn)中采用單點(diǎn)控制即可，取樣時(shí)間點(diǎn)一般為30～60 min，溶出限度通常應(yīng)在70%～不少于85%.從本品的溶出曲線可以看出，15 min時(shí)溶出限度就已經(jīng)達(dá)到85%左右，因此選取30 min為取樣點(diǎn).

2.2.5 阿哌沙班片溶出度測(cè)定方法確定.

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將阿哌沙班片溶出方法確定為：取本品，按照溶出度測(cè)定法(《藥典》2015年版四部 通則0931)，以0.1%CTAB-pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r/min，經(jīng)30 min時(shí)，取溶液10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液.另精密稱取阿哌沙班對(duì)照品適量，加0.1%CTAB-pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液制成每1 mL含11 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液.按照高效液相色譜法(《藥典》2015年版二部附錄ⅤD)測(cè)定：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱溫為35 ℃，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)pH值至3.0)-乙腈(45∶55)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm.精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，理論板數(shù)按阿哌沙班主峰計(jì)算不低于5 000.精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每片溶出量，限度為標(biāo)示量的80%.

2.3 溶出度測(cè)定結(jié)果

依據(jù)上述溶出度測(cè)定法，測(cè)定6批供試品的溶出度，結(jié)果見(jiàn)表7.

表7 溶出度檢查結(jié)果

由表7結(jié)果可知：6批供試品及對(duì)照藥品30 min的溶出度均在80%以上，均符合規(guī)定.

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)阿哌沙班片溶出度含量檢測(cè)方法和溶出度實(shí)驗(yàn)方法的研究，建立了可控制其質(zhì)量的溶出度測(cè)定方法.該方法操作方便快捷，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確.

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Study on Dissolution Determination Method of Apixaban

GUOZhaoyuan1,NIEZhongli2,HUYibing2,ZENGJi2,WANGXiaoling3,YEDing3,ZHANGYong3,XIAOMaoling3,GUORui3

1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University, Chengdu 610052， China;2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China；3.Chengdu Climb Phamaceutical Technology Co., Ltd., Chengdu 610041, China)

The paper is going to establish a method of dissolution determination of Apixaban.The establishment of the determination method for dissolution of Apixaban tablets is based on High Performance Liquid Chromatography.Phosphate buffer solution of 0.1% CTAB-pH 6.8 is used as dissolution medium which is degassed at 37±0.5 ℃,with the rotate speed of 75 r/min and the sampling time of 30 min.The results show that the dissolution of six batches of test samples and reference drug is over 80% in 30 min.It is in compliance with the regulations.The method can be used to determine the dissolution of Apixaban tablets with its selective,sensitive and accurate traits.

Apixaban tablets;dissolution;High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

1004-5422(2016)04-0317-04

2016-11-02.

郭兆元(1991 — )， 男， 碩士研究生， 從事藥物制劑與分析研究.

R927.11

A