PCR檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中的臨床效果分析

王冬梅

PCR檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中的臨床效果分析

王冬梅

目的探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中的臨床效果。方法86份細(xì)菌樣本,隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各,43份。對(duì)照組采用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢驗(yàn),觀察組應(yīng)用PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn)。比較兩種檢查方法的陽(yáng)性檢出率。結(jié)果觀察組陽(yáng)性檢出率為77%,明顯高于對(duì)照組的30%(P＜0.05)。結(jié)論P(yáng)CR檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中具有較高檢出率,準(zhǔn)確度高,檢測(cè)成本低廉,操作簡(jiǎn)便,檢出迅速,值得臨床廣泛應(yīng)用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；細(xì)菌檢驗(yàn)；臨床效果

細(xì)菌檢驗(yàn)在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中占有重要的位置,為臨床疾病的診斷和治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)。近年來(lái),隨著臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的不斷改進(jìn),隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,PCR檢驗(yàn)在臨床感染性疾病的診斷和治療中獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［1,2］。通過(guò)PCR的應(yīng)用能夠快速且準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)菌檢驗(yàn)。本文主要通過(guò)對(duì)本院細(xì)菌樣本進(jìn)行研究,探討PCR檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中的臨床效果,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2015年1月～2016年1月收集的86份細(xì)菌樣本進(jìn)行研究,其中糞便樣本21份,尿液樣本25份,膿腫樣本30份,血液樣本10份。所有研究樣本都經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的采集和送檢流程,隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組,各43份。觀察組糞便樣本10份,尿液樣本13份,膿腫樣本12份,血液樣本8份；對(duì)照組糞便樣本11份,尿液樣本12份,膿腫樣本18份,血液樣本2份。兩組樣本一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 檢驗(yàn)方法 對(duì)照組：按臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程采集患者糞便標(biāo)本接種于SS、麥康凱培養(yǎng)基,尿液、膿腫標(biāo)本接種于血平板,放入溫箱孵育培養(yǎng)24 h；采集靜脈血8～10ml,立即注入血培養(yǎng)瓶,采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的Bact / ALERT 3D 60型血培養(yǎng)儀進(jìn)行標(biāo)本培養(yǎng)。儀器發(fā)出陽(yáng)性報(bào)警時(shí),查看細(xì)菌生長(zhǎng)曲線,并用無(wú)菌注射器抽取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液直接涂片,經(jīng)革蘭染色鏡檢后,報(bào)告結(jié)果。同時(shí)將抽取的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于血平板、麥康凱平板(35℃)、巧克力平板5%CO2、35℃培養(yǎng)18～24 h,待菌落形成后,采用法國(guó)梅里埃Vitek-2 Compact微生物細(xì)菌鑒定儀對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)檢測(cè)。

觀察組：應(yīng)用PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn),ABBOTTm2000全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng),把觀察組樣本放在生理鹽水中,進(jìn)行離心處理,離心速度為1200 r/min,操作時(shí)間為10min,然后去除上清液,加入堿性裂解液并且放置于98℃的溫度環(huán)境中進(jìn)行加熱,再重新進(jìn)行離心處理,取其上清液作為基因模板,并且使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)要求設(shè)置循環(huán)參數(shù),針對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)液的檢驗(yàn)結(jié)果需要嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書與PCR檢驗(yàn)試劑的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩種檢查方法陽(yáng)性檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組陽(yáng)性檢出率為77%,明顯高于對(duì)照組的30%(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組陽(yáng)性檢出情況比較［n,n(%)］

3 討論

細(xì)菌檢驗(yàn)作為臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的重要組成部分,在疾病的臨床診斷和治療中發(fā)揮著重要的指導(dǎo)作用。目前,臨床常用于細(xì)菌檢驗(yàn)的方法是細(xì)菌培養(yǎng)方法,該種方法操作簡(jiǎn)單,在細(xì)菌檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛。然而,細(xì)菌培養(yǎng)方法受到多方面因素的影響,導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果存在一定的誤差,且從標(biāo)本采集到出結(jié)果報(bào)告需要時(shí)間較長(zhǎng)(3～7 d)［3］。

PCR檢測(cè)法,是一種通過(guò)體外酶促擴(kuò)增特定基因或者序列的技術(shù),需要經(jīng)歷高溫變性、低溫退火、適溫延伸的周期,以固定的循環(huán)數(shù)擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)特定DNA的迅速增加。PCR檢驗(yàn)方法在各類基因表達(dá)及相應(yīng)的檢驗(yàn)領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用,包括基因克隆、遺傳鑒定、傳染病病原分析。采用PCR方法對(duì)病原菌進(jìn)行檢驗(yàn),必須注意針對(duì)該菌特異的保守序列設(shè)計(jì)適宜的引物,以免非特異性片段對(duì)PCR的擴(kuò)增效果產(chǎn)生不良影響。目前,應(yīng)用 PCR 方法檢測(cè)感染性病原的主要方向包括兩方面：①檢測(cè)每一種病原的單個(gè)特異基因,可同時(shí)檢測(cè)一種或幾種病原體是否存在；②檢測(cè)某一病原的多個(gè)基因,可以減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。呂虹等［4］研究人員基于復(fù)合探針技術(shù)原理,以blaNDM-基因作為待檢靶基因建立檢測(cè)方法,對(duì)PCR擴(kuò)增體系中鎂離子濃度、PCR退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)檢測(cè)的靈敏性、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行評(píng)價(jià),研究顯示,以靈敏度質(zhì)控品進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn),最低檢測(cè)限可達(dá)2拷貝/體系；非耐藥性菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；批間批內(nèi)變異系數(shù)均＜5%；只有產(chǎn)NDM-1的鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)為陽(yáng)性,其他377株臨床分離菌和陰性對(duì)照均無(wú)響應(yīng),由此可見,PCR檢驗(yàn)法在檢測(cè)含blaNDM-1基因的菌株方面具有很好的靈敏性、特異性和重復(fù)性。劉廣文等［5］利用熒光定量PCR檢測(cè)El Tor型霍亂弧菌染色體上目的基因zot與基準(zhǔn)基因thyA的Ct值差值,根據(jù)已知拷貝數(shù)菌株N16961的兩基因Ct值之差來(lái)推算待測(cè)菌株中zot基因的拷貝數(shù),研究證明PCR檢驗(yàn)法可以準(zhǔn)確檢測(cè)菌株染色體上的基因拷貝數(shù)。

雖然對(duì)各學(xué)科的研究在不斷深入,檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新和完善,新方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了舊方法的不足,但是也會(huì)受到一些因素的限制,例如檢測(cè)儀器價(jià)格高昂、檢測(cè)儀器對(duì)樣品的純度要求嚴(yán)格等,不利于廣泛應(yīng)用。PCR 技術(shù)既具備快捷、簡(jiǎn)便、精密準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),又具備特異性好,靈敏度高便于檢測(cè)成組樣本等優(yōu)勢(shì),降低了檢測(cè)成本,縮短了檢測(cè)時(shí)間。PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用必將為獸醫(yī)公共衛(wèi)生營(yíng)養(yǎng)健康和疾病預(yù)防事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。

綜上所述,PCR檢驗(yàn)法在細(xì)菌檢驗(yàn)中具有較高的檢出率,準(zhǔn)確度高,檢測(cè)成本低廉,操作簡(jiǎn)便,檢出迅速,值得臨床廣泛應(yīng)用。

［1］王榮山,吳亦棟,尚世強(qiáng),等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌方法的建立及其臨床應(yīng)用.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,8(4):242-245.

［2］王蒙,徐志毅,高斐,等.PCR檢測(cè)細(xì)菌16s rRNA基因在臨床感染性疾病診斷中的應(yīng)用.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2011,6(14):88-89.

［3］王嬋媛,吳永貴,齊向明,等.PCR和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)腹膜透析相關(guān)性腹膜炎致病菌的對(duì)比分析.中華腎臟病雜志,2015,31(12):898-904.

［4］呂虹,劉志紅,劉琪琦,等.復(fù)合探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因blaNDM-1方法的建立.生物技術(shù)通訊,2012,23(3):411-414.

［5］劉廣文,閆梅英,梁未麗,等.熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌染色體上基因拷貝數(shù).中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(4):379-382.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.023

2016-04-25］

528329 廣東省佛山市順德區(qū)均安醫(yī)院檢驗(yàn)科