抗肝癌合劑對人肝癌細胞凋亡及間隙連接通訊功能的影響

王苗娟 陳 瑜 殷 瑛

抗肝癌合劑對人肝癌細胞凋亡及間隙連接通訊功能的影響

王苗娟 陳 瑜 殷 瑛

目的探討抗肝癌合劑（IPAH）對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞凋亡和間隙連接通訊功能的影響。方法制備抗肝癌合劑含藥血清，分為高、中、低劑量組，另設陰性對照組和空白血清對照組。培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721進行體外實驗，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，熒光漂白恢復實驗（FRAP）觀察對細胞間隙連接通訊功能的影響。結果抗肝癌合劑中劑量組24、48、72h細胞凋亡率分別為（8.07±1.12）%、（12.04±2.12）%、（17.90±1.74）%；高劑量組24、48、72h細胞凋亡率分別為（11.54±2.23）%、（18.29±2.39）%、（22.90±2.43）%，與陰性對照組 [（2.42±1.15）%、（2.98± 0.92）%、（3.35±0.67）%]及空白對照組[（3.01±1.07）%、（3.88±0.97）%、（4.09±1.23）%]比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）?？垢伟┖蟿┑汀⒅?、高劑量組熒光恢復率分別為（22.43±2.62）%、（42.73± 4.36）%、（49.40±5.13）%，隨著時間和劑量增加，熒光恢復率明顯增加，組間差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。結論抗肝癌合劑具有誘導肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡的作用，呈一定的劑量和時間依賴關系。其作用可能與上調細胞間隙連接通訊功能相關。

肝癌；細胞凋亡；間隙連接；抗肝癌合劑

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carclnoma，HCC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其預后差，居所有惡性腫瘤死亡率第3位[1]。我國是全球肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年患病者占全球的55%，肝癌為我國第二位惡性腫瘤致死病因。由于該病起病隱匿、進展迅速、早期就診率低，60%～70%的患者在確診時已處于腫瘤晚期，喪失了手術治療的機會，只能進行姑息性的對癥支持治療[2]。浙江省中醫(yī)院腫瘤科國家級名中醫(yī)導師周維順教授根據(jù)中醫(yī)對肝癌的認識，通過長期臨床摸索，以清熱解毒、舒肝理氣、活血化瘀為主要治則，自擬抗肝癌合劑（由柴胡、半枝蓮、蛇舌草、貓人參、生米仁、八月札、莪術等藥物組成），經臨床實踐證實其對提高肝癌患者生存期、改善患者生存質量有較肯定的療效[3]。本實驗通過抗肝癌合劑含藥血清作用于人肝癌細胞系SMMC-7721細胞，探討其對人肝癌細胞凋亡及間隙連接通訊功能的影響。

1 實驗材料

1.1 材 料 雌性日本大耳白兔4只，體質量（1.5± 2.5）kg，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）2015-0004。人肝癌細胞株SMMC-7721購自浙江大學附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所。

1.2 藥 物 抗肝癌合劑（主要由半枝蓮、白花蛇舌草、貓人參、貓爪草、茯苓、豬苓、靈芝、蒲公英、柴胡、赤芍、白芍、郁金、莪術等16味中藥組成），由浙江省中醫(yī)院制劑室提供（批號20140215），濃度為每毫升含生藥5.2g。

1.3 試 劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶，二甲基亞砜（DMSO）均購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。Hoechst33342/PI試劑盒購自南京凱基生物公司。6-羧基熒光素乙酰乙酸鹽（6-Carboxy fluocein diacetate，6-CFDA）購自美國Molecular Probe公司。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 雌性日本大耳白兔4只，隨機分成空白對照組和中藥高、中、低劑量組，每組1只。給藥前所有白兔均禁食、禁水12h，按《人和動物體表面積折算等效劑量比值表》計算灌胃劑量。中藥低劑量組灌胃量相當于人臨床等效劑量，按每只動物14.3g/（kg·d）給藥，中劑量組取低劑量組的5倍量，高劑量組按低劑量組10倍量給藥。空白組灌胃蒸餾水1h后，心臟取血。其余三組連續(xù)灌胃抗肝癌合劑3天，每天早、晚各1次，最后一天全天量一次性灌胃后1h，心臟取血，分離血清，56℃滅活，微孔過濾滅菌，置于-20℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞（SMMC-7721）在含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，1～2天更換培養(yǎng)液1次。待細胞單層鋪滿瓶底后，加0.25%胰蛋白酶，置培養(yǎng)箱內1～2min，待鏡下細胞固縮時，用尖吸管吹打細胞使其懸于液體中，加培養(yǎng)液終止消化，將細胞收集于離心管中，1000r/min離心5min，去除胰酶及舊培養(yǎng)液，重懸于細胞培養(yǎng)液中，以1∶3傳代培養(yǎng)。

2.3 實驗分組 分陰性對照組（PBS溶劑組）、空白血清對照組、含藥血清高、中、低劑量組。

2.4 流式細胞儀（FCM）細胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期細胞，應用前應RPMI-1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，按1×105/mL個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內，每組均設6個復孔，每孔加入3mL。在5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24h后，添加血清濃度為20%，陰性對照組加等量的PBS液。處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，胰酶消化并離心（1000r/min，10min）收集細胞，調整每管細胞濃度為106個/mL，PBS洗2次，加入0.5mL PBS重懸細胞，加入70%冰乙醇1～2mL迅速混勻，于4℃下固定過夜。棄除固定的乙醇，加入5mL PBS洗滌，移入離心管，低溫離心（1500r/min，5min），去上清液，重復PBS離心洗滌2次后，去上清，加1mL PI染料、100μL RNA酶，震蕩混勻，置4℃冰箱避光30min，300目尼龍網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件分析。

2.5 熒光漂白恢復實驗（FRAP）觀察對細胞間隙連接通訊功能的影響 （1）細胞爬片：取指數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液后計數(shù)，取36mm直徑的培養(yǎng)皿，內置24mm載玻片，每皿內添加細胞數(shù)為2.5×104個/mL，每皿內加培養(yǎng)液至3mL。培養(yǎng)36～48h至細胞大致鋪滿皿底時棄掉舊培養(yǎng)液，加入含藥血清0.6mL，另加新培養(yǎng)液2.4mL，即所加含藥血清濃度為20%。再培養(yǎng)24h后，細胞長至80%左右融合時上機檢測。陰性對照組和空白血清組則分別添加20%PBS液及空白血清，細胞長至80%左右融合時上機檢測。（2）6-CFDA著色：取出貼壁單層生長至70%～80%細胞的蓋玻片，先用Hank’s液清洗2～4次，再加入10μg/mL的6-CFDA 0.5～1.0mL，37℃、5%CO2孵箱中孵育10～15min。取出后用Hank’s液洗掉細胞外多余的6-CFDA，然后再加入少量Hank’s液，上機進行檢測。（3）GJIC功能測定：首先選擇兩種細胞：第1種是周圍與其它細胞緊密連接，需用激光去淬滅的細胞；第2種是周圍與其它細胞緊密連接，但不需要激光淬滅的細胞。顯然第1種細胞存在縫隙連接通訊，是我們實驗數(shù)據(jù)的來源；第兩種細胞選擇的原因是：熒光物質即使在無激光照射下，也有自身的熒光光漂白作用，選擇此種細胞作為其它細胞的背景校正。在確定以上兩種細胞后，開始淬滅前的預掃描，淬滅完成后，監(jiān)測兩種細胞15min，觀察其熒光恢復情況。全部的FRAP實驗在30～40min內完成，包括染料負載、漂洗、細胞選擇、淬滅細胞及掃描。各組實驗均在不同時間重復，每個實驗組淬滅10組細胞。

2.6 熒光漂白恢復率計算 應用公式F’（t）=F（t）-F （0）/F（∞）-Fa×100%計算熒光恢復率，其中F’（t）為某一時刻目標細胞的熒光恢復率；F（t）為該時刻目標細胞內熒光相對強度；F（0）為漂白結束時目標細胞的熒光相對強度；F（∞）為該時刻相鄰未漂白細胞內熒光相對強度；Fa為背景熒光相對強度。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差（±s） 表示。兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 抗肝癌合劑對人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響 抗肝癌合劑中劑量組、高劑量組對人肝癌細胞SMMC-7721有較明顯的誘導細胞凋亡的作用，并呈現(xiàn)出一定的時間和劑量依賴關系，與陰性對照組及空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。低劑量組與陰性對照組及空白對照組比較細胞凋亡差異不明顯（P＞0.05）。見表1。

表1 抗肝癌合劑對人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響（%，±s）

表1 抗肝癌合劑對人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響（%，±s）

注：與陰性對照組及空白對照組比較，▲P＜0.01

組別陰性對照組空白血清組低劑量組中劑量組高劑量組孔數(shù)6 6 6 6 6 24h凋亡率2.42±1.15 3.01±1.07 3.69±1.46 8.07±1.12▲11.54±2.23▲48h凋亡率2.98±0.92 3.88±0.97 4.22±1.19 12.04±2.12▲18.29±2.39▲72h凋亡率3.35±0.67 4.09±1.23 5.15±0.97 17.90±1.74▲22.90±2.43▲

3.2 抗肝癌合劑對細胞間隙連接通訊功能的影響（熒光漂白恢復實驗） 熒光標記染色SMMC-7721細胞呈單層貼壁生長。FRAP方法測定各組細胞的GJIC功能，選擇漂白細胞（箭頭標記）熒光漂白前（A）及漂白后5（B）、10（C）和15（D）min時的熒光恢復情況。在培養(yǎng)的實驗組細胞，經瞬間漂白后細胞內熒光強度明顯變弱，隨著時間的推移，熒光逐漸恢復，至15min時（D），可見熒光強度明顯恢復（見封二圖1～4）。相對而言，培養(yǎng)的對照組細胞，在相同的時間內，漂白細胞熒光恢復很不明顯。在漂白后15min，兩組平均熒光恢復率比較，實驗組顯著高于對照組（P＜0.05），各含藥血清組與空白對照及陰性對照組比較，熒光強度明顯恢復，平均熒光恢復率明顯增高（P＜0.01）?？垢伟┖蟿┤齻€劑量組間比較，隨著劑量的增大，熒光強度明顯恢復，平均熒光恢復率明顯增高（P＜0.01），見表2。

表2 抗肝癌合劑對人肝癌細胞系SMMC-7721熒光恢復率的影響（±s）

表2 抗肝癌合劑對人肝癌細胞系SMMC-7721熒光恢復率的影響（±s）

注：與空白對照及陰性對照組比較，▲P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.01；與中劑量組比較，*P＜0.01

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4 討論

細胞凋亡通常稱為程序性死亡（programmed cell death，PCD）。對多細胞動物機體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定起著極其重要的作用。誘導細胞凋亡已成為腫瘤治療的新途徑之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，尤以單味藥或其提取物或中藥單體成分研究為多[4]，中藥復方可能是“多靶點作用”[5]，而細胞凋亡的發(fā)生又具有多因素、多基因、多層次級聯(lián)作用特點，故復方中藥較單一成分藥物更有可能對基因表達的調控進行干預影響，以及調節(jié)基因代謝水平。本實驗發(fā)現(xiàn)，抗肝癌合劑中、高劑量組可誘導人肝癌細胞系SMM C-7721細胞凋亡，與陰性對照組及空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明肝癌合劑具有誘導肝癌細胞凋亡的作用。

細胞間隙連接（gap junction）是在哺乳類動物細胞接觸間普遍存在的的一種質膜結構，是相鄰細胞間進行物質和信息傳遞的重要膜通道結構。目前連接蛋白家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13個成員，分子量由26～56Kd不等，較為常見的有Cx26、Cx32、Cx43，它們的表達情況反映細胞通訊連接（GJIC）的功能狀況。自從發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞間的電偶聯(lián)喪失以來，許多學者相繼發(fā)現(xiàn)腫瘤和轉化細胞普遍存在GJIC功能的缺陷及Cx表達異常的現(xiàn)象，已證實GJIC在幾乎所有的實體瘤中表達下調或喪失，上調GJIC可以逆轉腫瘤細胞表形[6-7]。

近年研究提示，GJIC不僅調節(jié)細胞的增殖和分化，而且也參與調節(jié)細胞凋亡。有學者將Cx26基因轉染到人的肝細胞瘤中，Cx26的表達可以引起細胞的凋亡[8]。Uphan等[9]研究亦發(fā)現(xiàn)小鼠的肝上皮細胞系經過神經酰胺（包括一個C6和C8酰基團）的處理后，表現(xiàn)為GJIC功能下調及細胞凋亡的有效抑制，兩者呈正相關關系。由此可見，GJIC和細胞凋亡的異常在腫瘤中關系密切。

本實驗結果表明，抗肝癌合劑各劑量組可明顯增強人肝癌細胞系SMMC-7721的間隙連接通訊功能，說明抗肝癌合劑誘導細胞凋亡的作用可能與其可上調間隙連接通訊的功能相關，但具體作用機制仍不清楚，仍有待深入研究。

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［3］錢鈞，黃芳芳.抗肝癌合劑配合肝動脈灌注化療與栓塞治療原發(fā)性肝癌43例療效觀察［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2007，28（8）：6-7.

［4］王甜甜，韓倩倩，周新強，等.中藥抗腫瘤作用的研究進展［J］.中國醫(yī)療前沿，2013，8（13）：21-22

［5］濮忠建，華海清.中藥對肝癌細胞信號轉導通路影響的研究進展［J］.中國中藥雜志，2011，36（7）：951-954.

［6］Sharovskaya J,Kobliakova I,Solomatina N,et a1.Effect of some carcinogenic and noncarcinogenic Polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communication in hepatoma cell cultures［J］.Eur J Cell Biol，2006，85（5）：387-397.

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（收稿：2015-11-02 修回：2016-04-10）

Effects of Instant Powder of Anti-hepatocarcinoma on Apoptosis and Gap Junction Intercellular Communica- tion of Human Hepatocarcinoma Cells

>WANG Miaojuan,CHEN Yu,YIN Ying.Department of General Medicine,the First Clinical Medical College,Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the effect of instant powder of anti-hepatocarcinoma（IPAH）on inducedapoptosis and the function of gap junction intercellular communication（GJIC）of human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721.MethodsHigh-,middle-,and low-concentration drug serum was prepared.Negative control and blank control group were set up.Hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 was cultured with different sera in vitro and the apoptosis was detected by flow cytometry,and GJIC was observed with fluorescence recovery experiment （FRAP）.ResultsAt 24,48,and 72 h after culture,the apoptosis rate of SMMC-7721 cells in middle-concentration group were（8.07±1.12）%,（12.04±2.12）%,and（17.90±1.74）%,respectively and that in high-concentration group were（11.54±2.23）%,（18.29±2.39）%,and（22.90±2.43）%,respectively,which were higher than those of negative control group[（2.42±1.15）%,（2.98±0.92）%,（3.35±0.67）%]and blank control group[（3.01±1.07）%,（3.88± 0.97）%,（4.09±1.23）%],with all P＜0.01.Compared with controlled groups,the intensity of fluorescence in low-, middle-,and high-concentration groups were（22.43±2.62）%,（42.73±4.36）%,and（49.40±5.13）%;the intensity increased as the time and concentration increased,with a significant difference among groups（all P＜0.01）.ConclusionIPAH can induce the apoptosis of hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 apoptosis in a dose-and time-depended manner.This may be related to up-regulation of GJIC.

hepatocarcinoma;instant powder of anti-hepatocarcinoma（IPAH）;gap junction intercellular communication;apoptosis

浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院全科醫(yī)學科（杭州 310053）

王苗娟，Tel：15990107711；E-mail：wmj_79@126.com