大段異體骨移植鉆孔攜帶抗生素骨水泥釋放抗生素的效果研究*

張富軍 姬傳磊 李靖

大段異體骨移植鉆孔攜帶抗生素骨水泥釋放抗生素的效果研究*

張富軍 姬傳磊 李靖*

目的 觀察大段異體骨移植鉆孔攜帶抗生素骨水泥釋放抗生素特性可行性及濃度。方法 取24只大白兔隨機(jī)抽簽法分為 A、B、C、D組，每組6只建立兔脛骨骨缺損模型，將異體骨分別用直徑1.2、1.5、1.8、2.0mm鉆頭鉆24個骨孔，并測量異體骨的表面積和孔的內(nèi)表面積，用40 g骨水泥固相與液相混合后加入2 g萬古霉素粉劑，分別填塞至異體骨的鉆孔內(nèi)，植入兔骨缺損處固定，在術(shù)后1、3、7、14、21、30天用注射器抽取0.3 mL生理鹽水并通過放置的引流管進(jìn)行沖洗，所得沖洗液用高效液相色譜儀測出的抗生素濃度。并求出異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值。結(jié)果4組抗生素在兔體內(nèi)持續(xù)平均釋放時間在30天以上，A組抗生素提洗量在30天低于最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為5.8∶1，B組接近最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為4.2∶1，C,D組的洗提量高于最小抑菌濃度差異有顯著性意義（＜0.05），該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值分別為3.2∶1和2.7∶1。結(jié)論大段異體骨移植鉆孔攜帶抗生素骨水泥抗生素析出釋放，在實(shí)驗(yàn)的30天中，異體骨表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥表面積的比值為為1∶3.2和1∶2.7時，萬古霉素的釋放量始終維持在高于有效的抗菌濃度。

骨缺損；異體骨；骨水泥；萬古霉素

在臨床上由于創(chuàng)傷、戰(zhàn)時火器傷等所致的大段骨缺損并不少見，目前采用的治療方法主要為同種異體骨段移植和帶血管自體骨移植[1]，大段骨缺損常常合并嚴(yán)重的感染，治療上較為棘手，不合理的治療方法很容易使病情進(jìn)展為感染性骨不連?？股鼐植烤忈屜到y(tǒng)不但能作為骨替代材料可以修復(fù)骨缺損外，還能在創(chuàng)口局部持續(xù)釋放較高高濃度的抗生素，從而發(fā)揮其強(qiáng)大的局部抗感染作用，在治療骨折感染骨缺損擁有潛在的廣闊臨床應(yīng)用前景[2]。采用同種異體骨段移植和帶血管自體骨移植手術(shù)時，由于移植骨占位不利于抗生素骨水泥的放置，選擇一種合適的抗生素骨水泥放置方法成為了該手術(shù)成功的必要條件。實(shí)驗(yàn)選擇了同種異體骨鉆孔攜帶抗生素骨水泥，通過對4種直徑孔在體內(nèi)攜帶抗生素骨水泥釋放特點(diǎn)的比較，為大段骨缺損采用同種異體骨段移植和帶血管自體骨移植的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

隨機(jī)選取新西蘭大白兔24只，4月齡體重約3～3.5kg，雌雄性不限，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。指骨鋼板、螺絲釘、電鉆、不同直徑克氏針、擺鋸、磨鉆（強(qiáng)生辛迪斯），骨水泥（強(qiáng)生公司），萬古霉素（浙江海正藥業(yè)公司），直徑2mm引流管（蘇州偉康公司），島津LC-10AD型高效液相色譜儀（第四軍醫(yī)大學(xué)骨科實(shí)驗(yàn)室），VP-ODS C18色譜柱（迪馬公司），TL-9900色譜工作站（北京泰立公司），該實(shí)驗(yàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 材料制備

將取下的1.5cm長兔脛骨骨段，實(shí)驗(yàn)組用直徑1.2、1.5、1.8、2.0mm克氏針各鉆孔24個，鉆孔將該側(cè)皮質(zhì)鉆透通髓腔。分別測量計算出異體骨的表面積和孔的內(nèi)表面積，將40g骨水泥固體相和液體相混合，加入2g萬古霉素攪拌成糊狀，填塞至鉆好的骨孔內(nèi)（圖1，彩圖見插頁）。

1.3 動物模型建立

取實(shí)驗(yàn)用兔，稱體重量，于兔耳緣靜脈注射2%戊巴比妥2mL/kg進(jìn)行全身麻醉，術(shù)中必要時可進(jìn)行兔耳緣靜脈追加確保良好的麻醉狀態(tài)，兔仰臥位四肢伸展，右腿部去毛，采用0.5%碘伏消毒，鋪無菌手術(shù)單。在脛骨前外側(cè)處做一弧形切口長約3cm，切開皮膚、皮下組織及深筋膜，顯露脛骨遠(yuǎn)近端外側(cè)。用擺鋸分別在脛骨近端及遠(yuǎn)端截骨，制造1.5cm長之脛骨骨缺損，在脛骨近端靠近骨缺損端由皮質(zhì)向髓腔鉆孔，由該孔引入細(xì)引流管一根，引流管頭端剪多個側(cè)孔，將制備好的攜帶抗生素骨水泥同種異體骨段移植到骨缺損處，將引流管放置在異體骨髓腔，并用10孔鋼板固定（圖2，彩圖見插頁）。最后縫合手術(shù)切口，對照組將抗生素骨水泥栓放置在異體骨髓腔內(nèi)固定，在脛骨近端靠近骨缺損端由皮質(zhì)向髓腔鉆孔，由該孔引入細(xì)引流管一根放入髓腔內(nèi)。

1.4 檢測指標(biāo)

在術(shù)后1、3、7、14、21、30天分別用注射器抽取0.3mL生理鹽水，通過放置的引流管進(jìn)行沖洗，沖洗所得的液體液用高效液相色譜儀測出所含的抗生素濃度，即為每個樣品在每一時段的抗生素濃度，即洗提速率（mg/L），并以此來計算每組的平均洗提率和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析

共納入24只大白兔，所有動物均耐受手術(shù)，無局部感染、無死亡及其他并發(fā)癥。引流管通暢無污染、無脫落，所有移植骨與宿主骨均骨性愈合，無延遲愈合或不愈合。

2.2 抗生素在動物體內(nèi)洗提實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各時間點(diǎn)及各組沖洗液測量結(jié)果見表1。由表1所得的抗生素釋放曲線（見圖3，彩圖見插頁）顯示，起初術(shù)后第1天出現(xiàn)一個明顯的釋放高峰，術(shù)后第1天萬古霉素的釋放量最高，之后4組抗生素的釋放均逐漸減少呈緩慢釋放狀態(tài)，4組抗生素在兔體內(nèi)持續(xù)平均釋放時間在30天以上，A組抗生素提洗量在21天即接近最小抑菌濃度，在30天低于最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為5.8∶1，B組在30天接近最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為4.2∶1，C,D組的洗提量均遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度差異有顯著性意義（＜0.05），該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值分別為3.2∶1和2.7∶1。

表1 各時間點(diǎn)各組沖洗液中萬古霉素濃度（±s，mg/L）

表1 各時間點(diǎn)各組沖洗液中萬古霉素濃度（±s，mg/L）

術(shù)后時間（天） A組 B組 C組 D組1694.79±11.83949.94±16.171237.63±21.071447.52±24.64 676.26±40.57 7 3 324.60±19.47 137.16±15.82 443.80±26.63 578.20±34.69 244.33±28.18285.77±32.96 14 21 19.00±4.47 36.93±7.97 187.54±21.63 50.49±10.89 25.99±6.12 65.79±14.19 76.94±16.60 39.60±9.32 33.86±7.97 301.46±0.18 3.84±0.98 11.51±3.88 13.46±4.54

圖3 各組萬古霉素釋放曲線

3 討論

目前對于骨缺損治療方法主要有自體骨移植、同種異體骨滅活后移植、生物醫(yī)用材料（人工骨）填充骨缺損。其中自體骨移植被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，抗生素骨水泥聯(lián)合自體骨移植、治療骨缺損可控制感染的發(fā)生，促進(jìn)骨折愈合，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能[3]。但是由自體骨提供的植骨量有限，無法提供功能與結(jié)構(gòu)均相同的長段骨，且后期有植骨塊骨折、骨吸收等問題。同種異體骨可補(bǔ)充這些的缺陷，大段同種異體骨移植則不受形狀與數(shù)量的限制，可達(dá)到即時的骨量要求，其骨愈合過程與傳統(tǒng)的長段自體移植骨類似，但大段異體骨經(jīng)過了多種滅菌處理過程缺乏自身成骨作用，所以骨愈合過程緩慢，骨吸收嚴(yán)重骨不愈合率高及遠(yuǎn)期效果不理想。單純長段異體骨移植最終結(jié)局往往失敗，帶血管的自體骨移植包含有成骨活性的骨細(xì)胞，有豐富的血供，其愈合過程由爬行替代可轉(zhuǎn)化為一般的骨折愈合過程，其成功率較高可一期修復(fù)骨缺損，但數(shù)量極其有限、結(jié)構(gòu)局限不能早期負(fù)重[4]。長段異體骨結(jié)合自體帶血管骨移植修復(fù)四肢大段骨缺損，保存了大段異體骨的物理強(qiáng)度，并且可提供豐富血供加速異體骨活化促進(jìn)骨愈合，較好地解決長段骨缺損修復(fù)的難題[5]，大段骨缺損合并感染的患者，因骨缺損所造成的殘腔內(nèi)含有大量的致病菌，不論應(yīng)用何種方法清創(chuàng)都無法保證骨缺殘腔內(nèi)沒有致病菌，故植入異體骨還是自體骨均有極大失敗的可能性[6]，而植入抗生素骨水泥可有效的控制感染[7]。長段異體骨結(jié)合自體帶血管骨移植修復(fù)四肢大段骨缺損由于移植骨的占位，無法放置抗生素骨水泥，本實(shí)驗(yàn)采用對大段異體骨鉆孔來攜帶抗生素骨水泥，成功將抗生素骨水泥放置到了骨孔中，避免了骨水泥放置在異體骨周圍而占位，并且無需二期取出骨水泥。鉆孔的方法具有簡單、迅速、不易醫(yī)源性骨折等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)觀察了4種鉆孔放置萬古霉素骨水泥的方法，該方法在兔骨局部均能有效的釋放出萬古霉素，該方法萬古霉素骨水泥的釋藥規(guī)律基本符合Higuchi方程，即抗生素釋放速率與時間的平方根呈正比（洗提速率隨時間呈指數(shù)樣遞減趨勢）。由于手術(shù)創(chuàng)傷、周圍軟組織的破壞和死骨及殘腔的形成，病變局部對抗細(xì)菌的能力大大降低，使得細(xì)菌在病變局部大量繁殖，進(jìn)一步加重感染。由于細(xì)菌生物被膜的生成，所以在局部應(yīng)用抗生素，要想得到很理想的抗菌效果，從抗生素骨水泥中釋放出的抗生素濃度也必須遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度（Minimuminhibitory concentration,MIC）。起初術(shù)后第1天出現(xiàn)一個釋放高峰，4組術(shù)后第1天萬古霉素的釋放量最，均高遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度。A組抗生素提洗量在21天即接近最小抑菌濃度，在30天低于等于最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為1∶5.8，B組在30天稍高于最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值為1∶4.2，C,D組的洗提量均遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度，第30天 C,D組釋放的萬古霉素為11.51mg/L和13.46mg/L，遠(yuǎn)大于2～4mg/L的萬古霉素 MIC90[8]。異體骨表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥表面積的比值為為1∶2.2和1∶1.8。由此可見在實(shí)驗(yàn)的30天中C,D組萬古霉素的釋放量始終維持在較高的有效抗菌濃度，其二者抗菌效果相當(dāng)。研究表明抗生素的釋放隨著骨水泥的表面積增加而增加[9]，C,D組鉆孔抗攜帶生素骨水泥的表面積約為257.4mm2和301.6 mm2。由此可知當(dāng)異體骨表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥表面積的比值為為1∶2.2和1∶1.8時即可達(dá)到有效的抗菌濃度。開始的萬古霉素大劑量釋放可能是由于局部高滲透壓、高濃度所引起，能確保控制早期無細(xì)菌感染，之后的萬古霉素釋放變緩可能是由于局部環(huán)境中萬古霉素的飽和狀態(tài)[10]?？股毓撬嗑忈屜到y(tǒng)在治療骨髓炎的過程中，局部較高的抗生素濃度以及穩(wěn)定持續(xù)的抗生素釋放量，早期能有效的殺滅細(xì)菌后期可以防止耐藥菌株的出現(xiàn)，明顯提高治愈率。從骨水泥中釋放抗生素其主要機(jī)制是：抗生素的濃度梯度、抗生素小分子、骨水泥有較大孔隙等特性，抗生素從骨水泥內(nèi)部到表面彌散和順濃度的擴(kuò)散。有學(xué)者認(rèn)為抗生素骨水泥中抗生素的釋放濃度隨時間推移而逐漸降低，故骨水泥抗生素的含量越高，抗生素越容易釋放[11-13]。

上個世紀(jì)70年代初以來 PMMA-慶大霉素鏈珠臨床應(yīng)用獲得成功[14]，在局部使用抗生素骨水泥用來防治骨與關(guān)節(jié)感染得到了廣泛認(rèn)同，一期病灶徹底清除、髓腔或者局部植入萬古霉素骨水泥、結(jié)合使用全身敏感抗生素，在治療創(chuàng)傷性骨髓炎方面可獲得較好的臨床效果[15]。耐藥菌的不斷出現(xiàn)使抗生素的合理選擇成為這項技術(shù)的焦點(diǎn)。據(jù)報道，創(chuàng)面感染的耐甲氧西林葡萄球菌檢出比例占金黃色葡萄球菌41.18%[16]。萬古霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白合成，可以抑制細(xì)菌在界面組織內(nèi)粘附，阻止細(xì)菌在假體周圍形成蛋白被膜，在局部應(yīng)用有較高的殺菌濃度，局部殺傷力強(qiáng)，性能穩(wěn)定，其對多數(shù)革蘭氏陽性桿菌和球菌均有殺滅效果，于對有顯著耐藥性的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有100%的殺菌作用[15]。有報道每40g骨水泥中可用到2g萬古霉素不會影響骨水泥的強(qiáng)度[17]。魏波等[18]報在骨水泥液相與固相混合后再加入抗生素的混合方法更有利于抗生素的釋出。本實(shí)驗(yàn)采用上述的方法制備抗生素骨水泥取得了良好的釋放效果。萬古霉素是低毒副作用安全的抗生素，也是非常有效的抗菌素，這是本次研究選擇萬古霉素的主要原因。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)中4組抗生素在兔體內(nèi)持續(xù)平均釋放時間在30天以上，C,D組30天洗提量均遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度，該異體骨的表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥的表面積的比值分別為1∶2.2和1∶1.8。由此可知當(dāng)異體骨表面積與相應(yīng)抗生素骨水泥表面積的比值達(dá)到1∶2.2時即可產(chǎn)生有效的抗菌濃度。該方法具有局部抗菌效果肯定、簡單、迅速、不占據(jù)髓腔等優(yōu)點(diǎn)，有利于采用同種異體骨段移植和帶血管自體骨移植手術(shù)。

[1]王劍利，王五洲，郭永強(qiáng)，等.長段同種異體骨與自體帶血管組織組合治療大段骨缺損的總結(jié)[J].中華顯微外科雜志，2010，33（5）：371-374.

[2]葉增偉，劉隨意，蘇佳燦.抗生素/磷酸鈣骨水泥載藥緩釋系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].創(chuàng)傷外科雜志，2010，12（5）：472-474.

[3] 祝勇剛，張大偉，趙廣躍.抗生素骨水泥聯(lián)合自體骨移植及環(huán)形外固定架修復(fù)骨髓炎后脛骨缺損[J].中國組織工程研究，2015，25（19）：3942-3946.

[4]楊運(yùn)發(fā)，張光明，徐中和，等.吻合血管腓骨與異體骨復(fù)合移植修復(fù)四肢長段骨缺損[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2005，19（12）：986-988.

[5]Chong K W,C Y Woon,M K Wong.Induced membranes-a staged technique of bone-grafting for segmental bone loss：surgical technique[J].J Bone Joint Surg Am,2011,93(Suppl 1)：85-91.

[6]O'Malley N T,S L Kates.Advances on the Masquelet technique using a cage and nail construct[J].Arch Orthop Trauma Surg, 2012,132(2)：245-248.

[7]Takahira N,et al.Treatmentoutcomeof two-stagerevisiontotalhip arthroplasty for infected hip arthroplasty using antibiotic-impregnated cement spacer[J].J Orthop Sci,2003,8(1)：26-31.

[8]李家泰，齊慧敏，李耘，等.2002-2003年中國醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染革蘭陽性菌耐藥檢測研究[J].中華檢驗(yàn)雜志，2005，28，254-265.

[9]Masri B A,et al.Effect of varying surface patterns on antibiotic elution from antibiotic-loaded bone cement[J].J Arthroplasty, 1995,10(4)：453-459.

[10]Neut D,et al.Gentamicin release from commercially-available gentamicin-loaded PMMA bone cements in a prosthesis-related interfacial gap model and their antibacterial efficacy[J].BMC Musculoskelet Disord,2010,11：258.

[11]Neut D,et al.Residual gentamicin-release from antibiotic-loaded polymethylmethacrylate beads after 5 years of implantation[J]. Biomaterials,2003,24(10)：1829-1831.

[12]Bertazzoni ME,etal.Release of gentamicinand vancomycin from temporary human hip spacers in two-stage revision of infected arthroplasty[J].J Antimicrob Chemother,2004,53(2)：329-334.

[13]Sterling G J,et al.The pharmacokinetics of Simplex-tobramycin bone cement[J].J Bone Joint Surg Br,2003,85(5)：646-649.

[14]Taggart T,et al.The use of vancomycin-impregnated cement beads in the management of infection of prosthetic joints[J].J Bone Joint Surg Br,2002,84(1)：70-72.

[15]章曉云，陳躍平，龍飛攀，等.抗生素骨水泥治療創(chuàng)傷性脛骨骨髓炎的臨床療效分析[J].中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2015，30（4）：371-373.

[16]徐修禮，楊秋紅，孫怡群，等.MRSA凝固酶分型及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2004，29（3）：151-153.

[17]Espehaug B,et al.Antibiotic prophylaxis in total hip arthroplasty. Review of 10,905 primary cemented total hip replacements reported to the Norwegian arthroplasty register,1987 to 1995[J].J Bone Joint Surg Br,1997,79(4)：590-595.

[18]魏波，王宸，李賀.骨水泥不同時相負(fù)載抗生素[J].中國組織工程研究雜志，2012，16（25）：4581-4585.

The concentration of vancomycin released from antibotic bone cement carried by drilled massive bone allograft in a rabbit model

Zhang Fujun,Ji Chuanlei,Li Jing.
Department of Orthopaedics,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xian Shanxi,710032,China

Objective To measure the concentration of vancomycin released from vancomycin-composited bone cement carried by massive bone allograft and verify its feasibility in a rabbit model.Methods Twenty-four white rabbits were used to establish tibia defect model.These rabbits were randomly divided into four groups：group A,group B,group C and group D.Bone allografts were made from cryopreserved rabbit tibia and uniformly drilled twenty-four holes out of its cortex.The diameter of these holes was 1.2,1.5,1.8 and 2.0mm for group A,B,C and D,respectively.Vancomycin bone cement wasmadebyadding2gvancomycinpowdersinto40gmixtureofsolidphaseandliquidphaseofbonecement.Ineachgroup, bone allografts carried with different volume of vancomycin bone cements were implanted into the tibia defects and fixed. The superficial area ratio of bone allograft to bone cement in each group was calculated.The concentration of vancomycin intheflushingfluidacquiredat 1,3,7,14,21and30 dayspost-operation was measuredbyMPLC.Results The average releasetime ofvancomycinbone cement in fourgroups was greater than30 days.The superficialarearatioof boneallografts to bone cements was 5.8∶1,4.2∶1,3.2∶1 and 2.7∶1 for group A,B,C and D,respectively.The elution volume of vancomycin in group A was less than its minimal inhibitory concentration(MIC).In group B,vancomycin elution volume wasclosedtoMIC.IngroupCandD,vancomycinelutionvolumewashigherthanMIC(＜0.05).ConclusionVancomycin bone cement carried by drilled massive bone allograft can release vancomycin during 30 days after implantation.The preferable superficial area ratio of bone allograft to bone cement is 3.2∶1 and 2.7∶1.

Bone defect;Bone allograft;Bone cement;Vancomycin

R683

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.04.002

swgk2016-04-0078

張富軍（1972-）男，在讀博士，副主任醫(yī)師。研究方向：人工關(guān)節(jié)置換。

[作者簡介]姬傳磊（1981-）男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：骨腫瘤。

2016-04-14）

中國人民解放軍總后科研項目（項目編號：13CXZ054）

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，陜西西安710032

*[通訊作者]李靖（1973-）男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：骨腫瘤。

張富軍、姬傳磊為本文共同第一作者。