CDH1基因甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性研究

方日，王小文

(湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院中國(guó)人民解放軍第169醫(yī)院腫瘤科，湖南 衡陽(yáng) 421002)

CDH1基因甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性研究

方日，王小文

(湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院中國(guó)人民解放軍第169醫(yī)院腫瘤科，湖南 衡陽(yáng) 421002)

目的 探討CDH1基因啟動(dòng)子所在5'-CpG島的異常甲基化與臨床病情發(fā)展、病理變化及術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性。方法選取2013年1～12月在我院腫瘤科進(jìn)行結(jié)直腸癌切除術(shù)的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者184例，其中甲基化組86例，非甲基化組98例，所有入選患者由專人進(jìn)行跟蹤隨訪。檢測(cè)CDH1基因啟動(dòng)子所在5'-CpG島的異常甲基化，通過(guò)全基因組擴(kuò)增技術(shù)對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)GenBank基因庫(kù)設(shè)計(jì)CDH1基因甲基化特異性引物及CDH1基因非甲基化特異性引物。結(jié)果甲基化組腫瘤直徑為(6.5±2.1)cm，大于非甲基化組的(3.2±2.2)cm，甲基化組腫瘤浸潤(rùn)性所占比例54.7%，高于非甲基化組的42.9%，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；甲基化組腫瘤分化程度(高分化14.0%，中分化36.0%)低于非甲基化組(高分化40.8%，中分化45.9%%)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；甲基化組淋巴轉(zhuǎn)移率為67.4%、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為31.4%，高于非甲基化組的21.4%和17.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；甲基化組臨床TNM分期更晚(甲基化組：Ⅰ期11.6%，Ⅱ期11.6%，Ⅲ期37.2%，Ⅳ期39.5%；非甲基化組：Ⅰ期27.6%，Ⅱ期32.7%，Ⅲ期20.4%，Ⅳ期19.4%)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；非甲基化組患者生存率(89.5%)高于甲基化組患者(68.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(RR=28.5，P＜0.01)。結(jié)論原發(fā)性結(jié)直腸癌患者腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞CDH1基因甲基化程度提高，惡性程度高，預(yù)后差。

結(jié)直腸癌；CDH1基因；甲基化；腹腔灌洗液；預(yù)后

基因CDH1是一種依賴鈣離子的細(xì)胞粘附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)，定位于染色體16q22.1的，對(duì)同種細(xì)胞細(xì)胞間的粘附有重要作用，它功能缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的相關(guān)性[1-2]。有研究報(bào)道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測(cè)到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達(dá)水平的降低[3]。在其他常見(jiàn)腫瘤如卵巢腫瘤、頭頸部腫瘤中也有不同程度的確實(shí)或表達(dá)水平降低[2，4]。位于5'-CpG島的CDH1基因啟動(dòng)子，其異常甲基化可影響上皮性鈣黏蛋白表達(dá)，進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究選用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，檢測(cè)甲基化特異性，獲取入選結(jié)直腸癌患者術(shù)中腹腔灌洗液，制備細(xì)胞懸浮液，檢測(cè)CDH1基因啟動(dòng)子所在5'-CpG島的異常甲基化，同時(shí)對(duì)其異常甲基化與臨床病情發(fā)展、病理變化及術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1～12月在我院腫瘤科進(jìn)行結(jié)直腸癌切除術(shù)的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者184例，所有入選患者由專人進(jìn)行跟蹤隨訪，隨訪頻率根據(jù)患者自身情況決定，隨訪截止日期2014年12月31日。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)并進(jìn)行監(jiān)督，所有患者及家屬對(duì)本研究?jī)?nèi)容及風(fēng)險(xiǎn)均表示知情并理解，并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸鏡檢診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌；鏡檢獲取活組織病理切片確認(rèn)為原發(fā)性結(jié)直腸癌；手術(shù)切除前未進(jìn)行任何放化療等輔助治療；影像學(xué)CT及MRI判定為可切除腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：心臟超聲、血生化、肺通氣等檢查顯示患者身體情況無(wú)法接受手術(shù)者結(jié)直腸癌腫瘤位于腹膜反折下者。

1.2 DNA提取及亞硫酸鹽修飾方法 患者麻醉后，在開(kāi)腹后、手術(shù)前溫?zé)嵘睇}水500 mL灌洗腹腔，收集灌洗液，以備檢查。腹腔灌洗液細(xì)胞懸浮，提取懸浮細(xì)胞DNA，測(cè)定DNA濃度及純度，操作嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行。使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。亞硫酸亞轉(zhuǎn)化試劑盒操作步驟如下：10 μg提取DNA加入5 μL濃度為3 mol/L的NaOH裂解液。37℃20 min變性。加入濃度為2 mol/L的NaHSO4溶液520 μL，所用NaHSO4溶液濃度為2 mol/L。加入濃度為0.2 mol/L氫醌溶液30 μL。50℃16～18 h水浴。DNA樣品、8%異丙醇2 mL加入DNA純化樹脂1 mL進(jìn)行濾析。加入3 mol/L醋酸鈉、無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。離心，棄上清。自然干燥。加入TE溶液20 μL溶解。使用全基因組擴(kuò)增技術(shù)對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA甲基化檢測(cè)方法 根據(jù)GenBank基因庫(kù)設(shè)計(jì)CDH1基因甲基化特異性引物及CDH1基因非甲基化特異性引物。其中CDH1基因甲基化特異性引物正義鏈為5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'，反義鏈為5'-TAATTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3'，擴(kuò)增片段116 bp。CDH1基因非甲基化特異性引物正義鏈為5'-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3'，反義鏈為5'-CACMCCAATCAACAACACA-3'，擴(kuò)增片段97 bp?？瞻讓?duì)照使用蒸餾水代替。陽(yáng)性對(duì)照使用體外Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶處理的人基因組全DNA。陰性對(duì)照組使用體外未經(jīng)處理的人基因組全DNA。檢測(cè)使用ABI7500 PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，加入甲基化引物、非甲基化引物、各對(duì)照組樣本、各檢測(cè)組樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)甲基化特異性。

1.4 甲基化的標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)測(cè)得CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組甲基化DNA拷貝數(shù)，計(jì)算甲基化比率，計(jì)算公式為甲基化百分?jǐn)?shù)=[甲基化DNA拷貝數(shù)/(甲基化DNA拷貝數(shù)+非甲基化DNA拷貝數(shù))]×100%。所得甲基化百分?jǐn)?shù)小于等于20%認(rèn)為非甲基化，大于20%認(rèn)為甲基化。將PCR所得產(chǎn)物使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像觀察所得條帶，出現(xiàn)甲基化條帶認(rèn)為甲基化，出現(xiàn)非甲基化條帶認(rèn)為非甲基化。綜合上述結(jié)果，將樣本及產(chǎn)物分為 甲基化組和非甲基化組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制生存曲線計(jì)算生存率。利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理比較 本組184例，其中男性109例，女性75例；年齡33～69歲，平均(48.2±9.6)歲。腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，甲基化組86例，非甲基化組98例。對(duì)兩組患者臨床病理結(jié)果檢查可知甲基化組腫瘤直徑大于非甲基化組(P＜0.01)，甲基化組腫瘤浸潤(rùn)性所占比例高于非甲基化組(P＜0.01)，甲基化組腫瘤分化程度低于非甲基化組(P＜ 0.001)，甲基化組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高于非甲基化組(P＜0.05)，甲基化組臨床TNM分期更晚(P＜0.01)，見(jiàn)表1、表2和表3。

2.2 預(yù)后比較 對(duì)所有患者進(jìn)行專人隨訪，隨訪時(shí)間為12～24個(gè)月。隨訪結(jié)果顯示，非甲基化組患者生存率(89.5%)高于甲基化組患者的生存率(68.7%) (P＜0.05)，見(jiàn)圖1。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，RR=28.5 (P＜0.01)。

表1 兩組患者的臨床病理比較(±s)

表1 兩組患者的臨床病理比較(±s)

組別 性別(例)年齡(歲)腫瘤直徑(cm)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[例(%)]遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[例(%)]女甲基化組(n=86)非甲基化組(n=98) t/χ2值P值男52 57 34 41 0.101 0.751 47.2±6.5 47.9±5.8 0.772 0.441 6.5±2.1 3.2±2.2 10.369＜0.01 58(67.4) 21(21.4) 39.582＜0.01 27(31.4) 17(17.3) 4.968 0.026

表2 兩組患者的腫瘤部位及大體類型比較[例（%）]

表3 兩組患者腫的瘤分化類型及TNM分期對(duì)比[例（%）]

圖1 患者生存曲線比較

3 討 論

消化道腫瘤的發(fā)病率、死亡率隨著我們社會(huì)進(jìn)步、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、飲食改變逐年增加，成為臨床上極為常見(jiàn)的腫瘤之一[6]。作為一個(gè)在眾多抑癌基因中研究較為透徹的CDH1，它的缺失或結(jié)構(gòu)改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[7]?；駽DH1是一種依賴鈣離子的細(xì)胞黏附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白，定位于染色體16q22.1的，對(duì)同種細(xì)胞細(xì)胞間的黏附有重要作用，對(duì)細(xì)胞的分化也有著促進(jìn)作用[8]。CDH1在細(xì)胞分化維持、細(xì)胞極性維持、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)維持等方面起著重要作用[9]。有研究報(bào)道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測(cè)到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達(dá)水平的降低[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CDH1表達(dá)缺失或表達(dá)水平降低是導(dǎo)致消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，CDH1基因表達(dá)下降的原因可能是其基因突變或上游啟動(dòng)子甲基化[12]。近期有研究報(bào)道稱，DNA上游啟動(dòng)子甲基化較其基因突變?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中更為常見(jiàn)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，基因表達(dá)降低的重要機(jī)理之一就是啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化[13]。因此，對(duì)DNA甲基化、甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性、甲基化與腫瘤相關(guān)基因的研究逐漸受到重視。

Katarzyna等[14]研究結(jié)果顯示，所納入研究的35例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化檢出率為48%，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌患者上皮性鈣黏蛋白水平的降低與CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化有著顯著的相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，納入標(biāo)準(zhǔn)的184例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中，CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化檢出率為46.7%。

基因的甲基化產(chǎn)生的影響包括腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細(xì)胞脫落、患者術(shù)后及其他輔助治療后預(yù)后等多方面[15]?；蚣谆梢詫?dǎo)致遠(yuǎn)處組織如腹腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞脫落，作為腹腔種植轉(zhuǎn)移的重要種子細(xì)胞。Yakirevich等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔灌洗液中無(wú)基因甲基化患者術(shù)后生存率高于、復(fù)發(fā)率低于發(fā)現(xiàn)基因甲基化患者。Benusiglio等[17]研究結(jié)果顯示，腹腔灌洗液中發(fā)現(xiàn)甲基化基因患者術(shù)后腹腔轉(zhuǎn)移率明顯高于無(wú)甲基化患者，此外，部分患者發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)腫瘤的肝肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，甲基化組患者淋巴轉(zhuǎn)移率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高于非甲基化組患者。隨訪結(jié)果進(jìn)行生存分析顯示，非甲基化組患者生存率高于甲基化組患者。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

綜上所述，腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞甲基化組患者較非甲基化組患者腫瘤直徑大，腫瘤浸潤(rùn)性所占比例高，腫瘤分化程度低，淋巴轉(zhuǎn)移率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，臨床TNM分期晚。隨訪結(jié)果顯示，非甲基化組患者生存率高。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細(xì)胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

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Correlation between CDH1 gene methylation status and clinical pathological characteristics and prognosis of colorectal cancer.

FANG Ri,WANG Xiao-wen.Department of Oncology,the 169thHospital of People's Liberation Army, Xiangnan Hospital Affiliated to Hunan Normal University,Hengyang 421002,Hunan,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between the abnormal methylation of 5'-CpG islands harboring cadherin 1(CDH1)gene promoter in and the development of clinical condition,pathological changes and postoperative prognosis.MethodsA total of 184 patients with colorectal cancer resection of primary colorectal cancer in Department of Oncology in our hospital were selected and divided into methylation group(n=86)and non-methylation group(n=98)from January to December 2013.All patients were selected and followed up by specially-assigned person. The abnormal methylation of 5'-CpG islands harboring cadherin 1(CDH1)gene promoter was detected,and modified DNA genome was amplified by whole genome amplification technology.CDH1 gene methylation specific primers and CDH1 gene non-methylation specific primers were designed according to GenBank.ResultsThe diameter of methylation group was significantly larger than that of non-methylation group[(6.5±2.1)cm vs(3.2±2.2)cm],and the proportionof tumor invasion was significantly higher than that of non-methylation group(54.7%vs 42.9%),with statistically significant difference(P＜0.01).Tumor differentiation degree in methylation group(high differentiation 14.0%,medium differentiation 36.0%)was significantly lower than that in the non-methylation group(high differentiation 40.8%,medium differentiation 45.9%),with statistically significant difference(P＜0.01).The rate of lymph node metastasis and the distant metastasis of methylation group were significantly higher than those of the non-methylation group(67.4%vs 21.4%, 31.4%vs 17.3%,P＜0.05).The clinical TNM staging was later in methylation group than non-methylation group(methylation group:11.6%in stageⅠ,11.6%in stageⅡ,37.2%in stageⅢ,39.5%in stageⅣ;non-methylation group:27.6% in stageⅠ,32.7%in stageⅡ,20.4%in stageⅢ,19.4%in stageⅣ),the differences were statistically significant(P＜0.01).The survival rate of patients in non-methylation group was significantly higher than those in methylation group (89.5%vs 68.7%,P＜0.01).Cox proportional hazard model results showed that CDH1 gene methylation of suspension cells in intraoperative abdominal lavage was an independent risk factor for prognosis in patients with primary colorectal cancer(RR=28.5,P＜0.001).ConclusionColorectal cancer patients with higher aberrant methylation of 5'-CpG of CDH1 gene promoter of suspension cells in abdominal lavage have higher malignancy,more metastasis and worse prognosis.

Colorectal cancer;Cadherin 1(CDH1)gene;Methylation;Peritoneal lavage;Prognosis

R735

A

1003—6350(2016)11—1779—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.019

2015-12-16)

方日。E-mail：fr5115@163.com