青蒿素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制探討

馬瑞松，江洪，李元紅，胡笑容，劉自強(qiáng)

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060；2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

青蒿素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制探討

馬瑞松1，江洪1，李元紅2，胡笑容1，劉自強(qiáng)1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060；2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

目的 探討青蒿素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其可能作用機(jī)制。方法采用大鼠心肌缺血再灌注模型(缺血30 min，再灌注4 h)，雄性SD大鼠30只根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(SO組，n=10)、缺血再灌注組(I/R組，n=10)和青蒿素治療組(A+I/R組，n=10，Artemisinin：25 mg/kg，Tid，造模前1 d灌胃)。檢測(cè)心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白I(cTnI)；檢測(cè)炎癥因子高遷移率族蛋白1(HMGB1)、白介素17A(IL-17A)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)；檢測(cè)總p38(t-p38)和磷酸化p38(p-p38)。結(jié)果與SO組比較，I/R組中心肌損傷標(biāo)記物CK[(3 891±245.44)U/L vs(1 539±140.57)U/L]、LDH [(1 917±140.54)U/L vs(889±87.23)U/L]、cTnI[(66.34±2.13)pg/mL vs(26.45±1.72)pg/mL]；炎癥因子HMGB1 [(0.423±0.059)vs(0.301±0.067)]、IL-17A[(149.29±5.88)pg/mL vs(55.26±4.33)pg/mL]、TNF-α[(185.27±5.61)pg/mL vs(95.34±3.56)pg/mL]、INF-γ[(418.86±12.37)pg/mL vs(223.35±10.51)pg/mL]、IL-6[(156.89±6.01)pg/mL vs (65.43±4.21 pg/mL]、p-p38[(0.416±0.025)vs(0.188±0.013)]表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與I/R比較，A+I/R組中心肌損傷標(biāo)記物CK[(1934±199.56)U/L]、LDH[(973±79.47)U/L]、cTnI[(38.1±2.69)pg/mL]和炎癥因子HMGB1(0.174±0.026)、IL-17A[(93.65±2.69)pg/mL]、TNF-α[(145.85±3.92)pg/mL]、INF-γ[326.54±9.81]pg/mL]、IL-6[(95.47±3.16)pg/mL]、p-p38[(0.297±0.021)]表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論青蒿素可能通過抑制p38MAPK通路減輕I/R中炎癥反應(yīng)；青蒿素亦可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌缺血再灌注損傷。

青蒿素；炎癥；p38MAPK；心肌缺血再灌注損傷

急性心肌梗死是威脅我國(guó)人民健康的首要因素之一，早期再灌注治療溶栓和急診經(jīng)皮冠脈介入治療(PCI)可以最大程度地減輕心肌梗死的危害，改善人民的生存質(zhì)量。組織缺血一段時(shí)間后再灌的同時(shí)也可以加重心肌組織的損傷，如凋亡和壞死，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注(I/R)損傷。缺血再灌注損傷是限制早期再灌注治療獲得最佳療效的首要因素，因此，如何減輕心肌I/R損傷從而最大程度改善患者生存質(zhì)量也是臨床的重要任務(wù)之一。

青蒿素是青蒿的活性成分，且在世界范圍內(nèi)被證實(shí)為100%有效的抗瘧藥[1]。前期研究證實(shí)，青蒿素除抗瘧作用外還可顯著減少心肌I/R損傷，主要作用機(jī)制可能與抗氧化以及清除氧自由基有關(guān)[2]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，青蒿素具有明顯的抗炎作用[3-5]。但青蒿素是否可以通過抑制炎癥反應(yīng)減弱心肌I/R損傷仍無相關(guān)研究。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們?cè)?015年11月至2016年1月進(jìn)行了如下研究：

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物準(zhǔn)備與分組 30只成年雄性SD大鼠，購于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。于恒溫、恒濕、明/暗交替(12 h)的環(huán)境喂養(yǎng)48 h。大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg，ip)后，仰臥固定于鼠板，氣管插管(頻率70次/min，吸呼比1:1.5，潮氣量3～4 mL/100 g)。胸骨左緣切口，暴露心臟，破心包膜；于左心耳下2～3 mm處將前降支與一個(gè)中間帶有凹槽的空心乳膠管一起結(jié)扎。結(jié)扎線下心肌變蒼白表明缺血成功。缺血30 min后，沿乳膠管凹槽剪斷結(jié)扎線再灌注4 h。再灌注4 h，2%戊巴比妥鈉麻醉(20 mg/kg，ip)，頸靜脈采血2 mL，迅速剪下心臟，剪除多余部分留取心梗區(qū)(白色)和缺血區(qū)(白色附近5 mm)用于檢測(cè)。30只大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(SO，n=10)：僅插管、開胸、LAD下穿線但不結(jié)扎；缺血再灌注組(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30 min，再灌注4 h；青蒿素治療組(A+I/R，n=10)：造模前1 d青蒿素灌胃(25 mg/kg。Tid)，造模同I/R組。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.1 分光光度法檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白I(cTnI) 靜脈采血后靜置10 min，待血液凝固后離心(3 000 r/min×15 min)，取血清。選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作檢測(cè)LDH和CK。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)心肌組織炎癥因子 制備心肌組織勻漿，選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作檢測(cè)心肌組織中白介素17A(IL-17A)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INF-γ)和白介素6 (IL-6)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各因子濃度(pg/mL)。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)HMGB1、總P38(t-p38)和磷酸化p38(p-p38)方法如前所述[6]，簡(jiǎn)言之，12% PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，HMGB1、anti-p38和anti-p-p38的一抗液體中孵育過夜，在相應(yīng)的二抗中孵育，ECL顯色。以β-actin為參照計(jì)算HMGB1、t-p38和p-p38的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠的心肌損傷標(biāo)記物比較 與SO組比較，I/R組中心肌損傷標(biāo)記物(LDH，CK和cTnI)水平均明顯升高(P＜0.05)；A+I/R組中CK和cTnI水平明顯升高(P＜0.05)，但LDH水平與SO組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中LDH、CK和cTnI水平明顯降低(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠的心肌損傷標(biāo)記物比較(±s)

表1 三組大鼠的心肌損傷標(biāo)記物比較(±s)

注：與SO組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05。

組別LDH(U/L)CK(U/L)cTnI(pg/mL) SO組I/R組A+I/R組F值P值889±87.23 1917±140.54a973±79.47b 175.7＜0.01 1539±140.57 3891±245.44a1934±199.56ab478.3＜0.01 26.45±1.72 66.34±2.13a38.1±2.69ab1858＜0.01

2.2 三組大鼠的心肌組織中炎癥因子表達(dá)比較 與SO組比較，I/R組和A+I/R組中炎癥因子(HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6)表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中炎癥因子(HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6)的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組大鼠的心肌組織中炎癥因子表達(dá)比較(±s)

表2 三組大鼠的心肌組織中炎癥因子表達(dá)比較(±s)

組別SO組I/R組A+I/R組F值P值HMGB1/β-actin 0.301±0.067 0.423±0.059a0.174±0.026ab51.59＜0.01 IL-17A(pg/mL) 55.26±4.33 149.29±5.88a93.65±2.69ab404＜0.01 TNF-α(pg/mL) 95.34±3.56 185.27±5.61a145.85±3.92ab479＜0.01 INF-γ(pg/mL) 223.35±10.51 418.86±12.37a326.54±9.81ab801＜0.01 IL-6(pg/mL) 65.43±4.21 156.89±6.01a95.47±3.16ab307＜0.01

2.3 三組大鼠的p38-MAPK通路比較 與SO組比較，I/R組中p-p38表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，但t-p38表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中p-p38水平明顯降低(P＜0.05)，但t-p38表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 三組大鼠的p38-MAPK通路比較(±s)

表3 三組大鼠的p38-MAPK通路比較(±s)

注：與SO組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05。

組別SO組I/R組A+I/R組p-p38/β-actin 0.188±0.013 0.416±0.025a0.297±0.021abt-p38/β-actin 0.624±0.037 0.636±0.040 0.628±0.041 F值P值39.87＜0.01 0.22 0.80

3 討 論

青蒿素是由我國(guó)專家最先從青蒿中提取的活性成分，因其100%的抗瘧性而受到世界的關(guān)注[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，青蒿素可以通過代謝為二氫青蒿素發(fā)揮顯著的抗炎作用。在風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性疾病中，青蒿素不但可以調(diào)節(jié)體液免疫還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，顯著抑制IL-1和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[7]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以調(diào)節(jié)T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)的表達(dá)，Treg細(xì)胞可以直接作用于未分化的CD4+T細(xì)胞或通過分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ)等細(xì)胞因子作用于未分化的CD4+T細(xì)胞，抑制Th17細(xì)胞的分化，Th17細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的輔助型細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17A。故青蒿素可以通過抑制IL-17A表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。在心臟方面，Gu等[3，8]發(fā)現(xiàn)青蒿素可以通過減弱心梗后炎癥反應(yīng)(TNF-α、IL-1β表達(dá))抑制心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)，以及惡性心律失常的發(fā)生，且可能與核因子kappaB (NF-kappaB)通路相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以顯著抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌酶和炎癥因子HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6的表達(dá)，有明顯的抗炎和心肌保護(hù)作用。

HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6均是心肌缺血再灌注損傷中典型的炎癥因子[9]，其表達(dá)水平反映了缺血再灌注損傷的炎癥水平。HMGB1是近年新發(fā)現(xiàn)的促炎因子，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用[10-11]。HMGB1存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)被釋放到細(xì)胞外，可作為一種獨(dú)立炎癥因子，加重局部的炎癥反應(yīng)，同時(shí)還可以通過HMGB1-TLR4-IL-23/IL-17A軸調(diào)節(jié)下游IL-6和TNF-α的分泌進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[12-14]。如上所述，青蒿素還可以作用于幼稚型CD4+T細(xì)胞抑制Th17的分化，進(jìn)而減少IL-17A的產(chǎn)生，減輕心肌缺血再灌注損傷，這也與本研究結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可顯著抑制I/R中p38MAPK通路激活。P38MAPK通路是一條經(jīng)典的炎癥通路，參與了多種炎癥反應(yīng)，包括心肌I/R損傷[14]。前期的研究證實(shí)，抑制p38MAPK通路激活可顯著抑制HMGB1等炎癥因子的釋放[12]。因此，青蒿素可能通過抑制p38MAPK通路，抑制心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)。

綜上所述，青蒿素可能通過抑制p38MAPK通路抑制HMGB1等炎癥因子表達(dá)，也可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌缺血再灌注損傷。

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Effects and mechanism of artemisinin on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.

MA Rui-song1,JIANG Hong1,LI Yuan-hong2,HU Xiao-rong1,LIU Zi-qiang1.1.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Cardiology,the Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects and possible mechanism of artemisinin on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.MethodsRat I/R models were established by ischemia 30 min and reperfusion 4 h. Thirty SD rats were divided into three groups according to the random number table:sham operation group(SO,n=10), ischemia and reperfusion group(I/R,n=10)and artemisinin treatment group(A+I/R,n=10).Cardiac injury markers,including creatine kinase(CK),lactate dehydrogenase(LDH),and cardiac troponin(cTnI)were detected.The inflammatory cytokines[high mobility group box protein 1(HMGB1),interleukin-17A(IL-17A),tumor necrosis factor-α (TNF-α),gamma interferon(INF-γ),interleukin-6(IL-6)],total p38(t-p38),phosphorylation p38(p-p38))were detected.ResultsCompared with SO group,I/R group was significantly higher(P＜0.05)in the cardiac injury markers of CK [(3 891±245.44)U/L vs(1 539±140.57)U/L],LDH[(1 917±140.54)U/L vs(889±87.23)U/L]and cTnI[(66.34±2.13)pg/mL vs(26.45±1.72)pg/mL],the inflammatory cytokines of HMGB1[(0.423±0.059)vs(0.301±0.067)],IL-17A[(149.29± 5.88)pg/mL vs(55.26±4.33)pg/mL],TNF-α[(185.27±5.61)pg/mL vs(95.34±3.56)pg/mL],INF-γ[(418.86±12.37)pg/mL vs(223.35±10.51)pg/mL],IL-6[(156.89±6.01)pg/mL vs(65.43±4.21)pg/mL],and p-p38[(0.416±0.025)vs(0.188± 0.013)].Compared with I/R group,A+I/R group was significantly lower(P＜0.05)in the cardiac injury markers of CK [(1 934±199.56)U/L],LDH[(973±79.47)U/L]and cTnI[(38.1±2.69)pg/mL],inflammatory cytokines of HMGB1 [(0.174±0.026)],IL-17A[(93.65±2.69)pg/mL],TNF-α[(145.85±3.92)pg/mL],INF-γ[(326.54±9.81)pg/mL],IL-6 [(95.47±3.16)pg/mL],and p-p38[(0.297±0.021)].ConclusionArtemisinin can inhibit inflammatory responses probably via suppressing p38 MAPK signaling pathway activation,and thus attenuate myocardial I/R injury.

Artemisinin;Inflammation;p38MAPK;Myocardial ischemia and reperfusion injury

R-332

A

1003—6350（2016）11—1734—03

2016-01-19)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81370308）；湖北省衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：WJ2015MA021）

江洪。E-mail：jianghwurm@163.com；李元紅。E-mail：yuanhongwhu@126.com