氨氯地平對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性和MMP-9及其抑制物表達(dá)的影響

孫劼，馮力，董劍廷，鄧志華，李飛

（中山市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 中山 528400）

氨氯地平對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性和MMP-9及其抑制物表達(dá)的影響

孫劼，馮力，董劍廷，鄧志華，李飛

（中山市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 中山 528400）

目的 探討氨氯地平對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)及其抑制物表達(dá)的影響。方法以18只雄性Wistar大鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只雄性Wistar大鼠分為氨氯地平組和模型組，每組9只。模型組采取單純高脂飼料喂養(yǎng)，氨氯地平組每日在高脂飲食基礎(chǔ)上給予苯磺酸氯氨地平6 mg/(kg·d)灌胃。連續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月后采血檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)；免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行MMP-9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)表達(dá)檢測(cè)，同時(shí)計(jì)數(shù)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。結(jié)果氨氯地平組大鼠TC和TG水平分別為(1.63±0.74)mmol/L和(0.81±0.21)mmol/L，明顯低于模型組的(3.08±0.67)mmol/L和(1.35±0.34)mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；氨氯地平組MMP-9表達(dá)水平為(266.53±32.15)μm2，明顯低于模型組的(351.02±45.69)μm2，TIMP-1表達(dá)水平為(305.64±36.22)μm2，明顯高于模型組的(230.36±25.11)μm2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；氨氯地平組血管平滑肌細(xì)胞[(88.12±3.58)%vs(100.00±0.00)%]和巨噬細(xì)胞[(90.35±5.33)%vs(100.00±0.00)%]占總細(xì)胞的百分比均顯著低于模型組(P＜0.05)。結(jié)論氨氯地平可抑制MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而起到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化板塊、降低血脂的作用。

Wistar大鼠；動(dòng)脈粥樣斑塊；氨氯地平；基質(zhì)金屬蛋白酶9；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1；血脂

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊破裂繼發(fā)血栓形成是臨床急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)公認(rèn)的主要原因[1]。不穩(wěn)定斑塊是指易于形成血栓，其通過(guò)形成持續(xù)的或瞬時(shí)性的管腔閉塞進(jìn)而導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)生[2-3]。因此，采取措施增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性將對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的防治有著重要的意義。既往研究顯示，長(zhǎng)期應(yīng)用鈣拮抗劑氨氯地平治療原發(fā)性高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，在有效控制血壓的同時(shí)可逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化[4]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)氨氯地平對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的基礎(chǔ)研究還十分有限，其機(jī)制并未明確。本文大膽猜測(cè)氨氯地平對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性產(chǎn)生影響可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrx metallop roteinases，MMPs)及其抑制物表達(dá)相關(guān)。本文以雄性Wistar大鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，探討氨氯地平對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性和MMP-9及其抑制物TIMP-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 18只健康雄性Wistar大鼠購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2015-0025)，體質(zhì)量310～350 g。18只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為氨氯地平組和模型組，每組9只。

1.2 主要儀器與試劑 苯磺酸氯氨地平(昆明金殿制藥有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；羊抗鼠MMP-9抗體(Bioworld公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純劑試劑；離心管(美國(guó)Corning公司)；超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司)；臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)(3K3，Sigma，美國(guó))；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Perlcin-Elmer USA)。

1.3 模型制備 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3 d，予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。試驗(yàn)過(guò)程中予以高脂飼料(2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，5%白糖，10%豬油，82.5%基礎(chǔ)飼料)，喂食為2次/d、20～40 g·只-1·d-1。模型組采取單純高脂飼料喂養(yǎng)，氨氯地平組每日在高脂飲食基礎(chǔ)上給予苯磺酸氯氨地平6 mg/(kg·d)灌胃。于第4周處死模型組和氨氯地平組各一只，取主動(dòng)脈弓遠(yuǎn)端主動(dòng)脈5 mm，病理切片，HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，證實(shí)AS斑塊形成，說(shuō)明造模成功。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 連續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月后采血檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)。之后處死動(dòng)物，首先取主動(dòng)脈根部作為切片標(biāo)本，中性甲醛固定，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，橫斷切片，免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行MMP-9及TIMP-1表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè)，同時(shí)計(jì)數(shù)每一高倍鏡視野下血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.5 結(jié)果判斷 MMP-9及TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，采用HMIAS-200彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性表達(dá)面積計(jì)算，每張切片選取9個(gè)視野，取每個(gè)視野的陽(yáng)性面積的平均值。CD68和a-SMA分別顯色于巨睡細(xì)胞的胞膜和VSMCs的胞質(zhì)，計(jì)數(shù)每張切片400倍高倍視野下動(dòng)脈內(nèi)膜下或粥樣斑塊內(nèi)巨嚼細(xì)胞數(shù)和平滑肌細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)的比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠的TC和TG比較 氨氯地平組大鼠TC和TG水平均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠的TC和TG水平比較(±s)

表1 兩組大鼠的TC和TG水平比較(±s)

只數(shù)組別TC(mmol/L)TG(mmol/L) 8 8氨氯地平組模型組t值P值1.63±0.74 3.08±0.67 2.318＜0.05 0.81±0.21 1.35±0.34 2.167＜0.05

2.2 兩組大鼠的MMP-9及TIMP-1表達(dá)水平比較 氨氯地平組大鼠的MMP-9表達(dá)水平明顯低于模型組，TIMP-1表達(dá)水平明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠的MMP-9及TIMP-1表達(dá)水平比較(±s)

表2 兩組大鼠的MMP-9及TIMP-1表達(dá)水平比較(±s)

只數(shù)組別MMP-9(μm2)TIMP-1(μm2)氨氯地平組模型組t值P值8 8 266.53±32.15 351.02±45.69 2.366＜0.05 305.64±36.22 230.36±25.11 2.343＜0.05

2.3 兩組大鼠的血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比較 氨氯地平組大鼠的血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠的血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比較(±s)

表3 兩組大鼠的血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比較(±s)

組別 只數(shù) 血管平滑肌細(xì)胞(%)巨噬細(xì)胞(%)氨氯地平組模型組t值P值8 8 88.12±3.58 100.00±0.00 2.159＜0.05 90.35±5.33 100.00±0.00 2.235＜0.05

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的形成為一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮的損傷、單核細(xì)胞和血小板集聚等。此外，細(xì)胞外基質(zhì)合成或降解代謝失衡等也參與了該過(guò)程，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，形成粥樣斑塊[5-6]?！吨袊?guó)高血壓防治指南2010》明確推薦使用長(zhǎng)效降壓藥，要長(zhǎng)期平穩(wěn)有效控制高血壓。氨氯地平屬于長(zhǎng)效二氫吡啶類的鈣離子拮抗劑降壓藥，每天使用1次可平穩(wěn)控制高血壓患者的血壓水平[7]。氨氯地平主要通過(guò)阻斷鈣離子通道阻斷鈣離子進(jìn)入心血管平滑肌細(xì)胞，舒張血管平滑肌，達(dá)到降低血壓的目的。

近年來(lái)，氨氯地平延緩AS早期斑塊的形成的作用受到廣泛關(guān)注，如其對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度的逆轉(zhuǎn)作用[8]。本組數(shù)據(jù)顯示，氨氯地平組大鼠TC和TG水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明氨氯地平具有良好的降脂效果。由于TC和TG水平升高受到限制，其沉積于血管內(nèi)皮下的量降低，從而延緩了斑塊核心的擴(kuò)大，有利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定。郝炎[9]對(duì)比分析了直接腎素抑制劑與鈣通道阻滯劑對(duì)腎動(dòng)脈狹窄性大鼠大動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)阿利吉侖和氨氯地平均具有顯著的降壓降脂作用，有利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，與本文報(bào)道一致。

本組數(shù)據(jù)顯示，氨氯地平組血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的重要構(gòu)成成分，高血壓、高血脂可導(dǎo)致群毆從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，從而獲得增殖、遷移的能力，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過(guò)程中具有重要作用。巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的主要來(lái)源，其基質(zhì)金屬蛋白酶可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)粥樣斑塊進(jìn)展[10]。因此，筆者推測(cè)氨氯地平可能降低了血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平水平，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過(guò)程。

MMP-9是MMPs家族中的一個(gè)亞型，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白-Ⅳ型膠原和層粘連蛋白的作用，在維持血管的穩(wěn)定性和完整性上具有十分重要的作用。TIMP-1由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制MMP-9的作用。本文發(fā)現(xiàn)，氨氯地平組MMP-9表達(dá)水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TIMP-1表達(dá)水平顯著高于模型組(P＜0.05)，提示氨氯地平可能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)起到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

綜上所述，氨氯地平可抑制MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而起到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化板塊和降低血脂的作用。

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Effect of amlodipine on the stability of atherosclerosis plague and the expression of MMP-9 and its inhibitor in mice.

SUN Jie,FENG Li,DONG Jian-ting,DENG Zhi-hua,LI Fei.Internal Medicine-Cardiovascular Department,the People's Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of amlodipine on the stability of atherosclerosis plague,and the expression of matrix metallopeptidase 9(MMP-9)and its inhibitor in mice.MethodsThe atherosclerosis model was built with 18 male Wistar rats,which were randomly divided into amlodipine group and model group,with 9 rats in each group. Rats in the model group was fed with high-fat diet,and those in amlodipine group were given gavage with 6 mg/(kg·d)amlodipine besylate on the basis of high-fat diet.Serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG)were detected after continuous feeding for three months.MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)expression was detected by immunohistochemistry SABC method,and the percentage of vascular smooth muscle cells(VSMC)and macrophages in total cells were calculated.ResultsTC,TG levels in amlodipine group were significantly lower than those in model group[(1.63±0.74)mmol/L vs(3.08±0.67)mmol/L,(0.81±0.21)mmol/L vs(1.35±0.34)mmol/L,P＜0.05].The expression level of MMP-9 in amlodipine group was significantly lower than that in model group[(266.53±32.15)μm2vs (351.02±45.69)μm2,P＜0.05],and the expression level of TIMP-1 in amlodipine group was significantly higher [(305.64±36.22)μm2vs(230.36±25.11)μm2,P＜0.05].The percentage of VSMC in total cells and the percentage of macrophages in total cells in amlodipine group were significantly lower than those in model group[(88.12±3.58)%vs (100.00±0.00)%,(90.35±5.33)%vs(100.00±0.00)%,P＜0.05].ConclusionAmlodipine can inhibit the expression of MMP-9,and thus play a stabilizing role in the atherosclerosis plate,which can also help reduce blood lipids.

Wistar rats;Atherosclerotic plaque;Amlodipine;Matrix metallopeptidase 9(MMP-9);Tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1);Blood fat

R-332

A

1003—6350（2016）06—0867—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.06.003

2015-11-16)

廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20091A088）

孫劼。E-mail：sj99363@126.com