犬腸道冠狀病毒基因型和重組的研究進(jìn)展

王欣宇，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

犬腸道冠狀病毒基因型和重組的研究進(jìn)展

王欣宇，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

犬腸道冠狀病毒（CCoV）與豬傳染性胃腸炎病毒、貓冠狀病毒同屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬、α-冠狀病毒-1成員。CCoV感染一般引起幼齡犬發(fā)生非致死性的輕度腹瀉，呈現(xiàn)高發(fā)病率、低死亡率的特點(diǎn)，當(dāng)與其他腸道病原混合感染時(shí)，能導(dǎo)致患病動(dòng)物高的死亡率。近年來(lái)，隨著CCoV高致病性的變異毒株在歐洲國(guó)家陸續(xù)報(bào)道，該病再一次引起了廣泛的關(guān)注。為了增加對(duì)CCoV近年來(lái)遺傳進(jìn)化的了解，對(duì)CCoV基因型和重組研究進(jìn)展做了綜述，為CCoV的深入研究提供參考。

犬冠狀病毒；基因型；重組變異

犬腸道冠狀?。–anine coronavirus，CCoV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）、α-冠狀病毒-1種（Alphacoronavirus-1）成員，是單股、正鏈、有囊膜的RNA病毒［1］。CCoV基因組長(zhǎng)為27～32 kb，編碼纖突糖蛋白（Spike protein，S）、膜蛋白（Membrane protein，M）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）和小膜蛋白（small envelope protein，E）。其中，CCoV S蛋白是位于病毒粒子表面的囊膜糖蛋白，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過(guò)膜融合侵入宿主細(xì)胞以及介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。自1971年首次在德國(guó)報(bào)道后，CCoV在亞洲、歐洲、南美洲、北美洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼被報(bào)道，呈現(xiàn)世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)犬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害［2］。在我國(guó)，徐漢坤等［3］在犬傳染性腸炎中首次報(bào)道了CCoV感染。此后，我國(guó)研究者對(duì)CCoV流行病學(xué)、病毒分離與鑒定、診斷方法、基因工程疫苗等方面展開(kāi)了廣泛而深入的研究［4-6］。Buonavoglia等［7］，在意大利，報(bào)道一個(gè)CCoV-II高致病性的變異毒株（CB/05毒株），能夠?qū)е氯叩闹滤缆?。高致病性CCoV毒株出現(xiàn)后，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)CCoV遺傳演化、致病性和重組展開(kāi)了廣泛的研究，積累了大量有價(jià)值的信息，增加了對(duì)CCoV的理解。根據(jù)目前研究成果，僅對(duì)CCoV基因型和重組研究進(jìn)展做一綜述，為CCoV相關(guān)研究提供參考。

1 CCoV基因分型及地理分布

Binn等（1971）首次在德國(guó)軍犬中成功分離出CCoV后，CCoV的遺傳演化得到了廣泛而深入的研究［2］。Pratelli等［8］報(bào)道，在意大利腹瀉幼犬中，一些CCoV毒株M基因出現(xiàn)點(diǎn)突變，這些非典型的CCoV毒株被命名為貓冠狀病毒類(lèi)似的CCoV毒株（FCoV-like CCoVs）。CCoV毒株ORF1a、ORF1b和ORF5序列分析發(fā)現(xiàn)，在CCoV陽(yáng)性的犬腹瀉樣品中，存在著2個(gè)不同的CCoV遺傳進(jìn)化群，一個(gè)遺傳進(jìn)化群由Insavc-1、K378等CCoV經(jīng)典毒株組成，而另外一個(gè)遺傳進(jìn)化群由FCoV-like CCoV毒株組成［9］。Pratelli等［10］測(cè)定了一個(gè)FCoV-like CCoV毒株（Elmo/02）S基因80%的核苷酸序列，進(jìn)化性分析表明，Elmo/02毒株與貓冠狀病毒I毒株（FCoV-I）表現(xiàn)出顯著的遺傳相似性（～81%氨基酸相似性），但是在進(jìn)化樹(shù)中與CCoV經(jīng)典毒株、FCoV-I型毒株和貓冠狀病毒II型毒株（FCoV-II）處于不同的進(jìn)化群中。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，Elmo/02毒株被指定為CCoV-I型毒株，而CCoV參考毒株被稱(chēng)為CCoV-II型毒株。與CCoV-II型毒株相比，CCoV-I型毒株（Elmo/02）在S基因下游含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框3（ORF3），編碼一個(gè)未知功能的糖蛋白。根據(jù)CCoV S蛋白N端結(jié)構(gòu)域（NTD，aa 1～300）氨基酸序列，CCoV-II型毒株被分為CCoV-IIa亞型和CCoV-IIb亞型。目前，CCoV-IIa和CCoV-IIb分類(lèi)在病毒學(xué)分類(lèi)中沒(méi)有被接受，但是在文獻(xiàn)報(bào)告中被廣泛應(yīng)用［11］。目前，根據(jù)M基因序列，能鑒別CCoV-I型毒株和CCoV-II型毒株；根據(jù)S基因部分序列，能鑒別CCoV-I、CCoV-IIa和CCoV-IIb型毒株［12］。

目前，研究者對(duì)不同CCoV基因型毒株在部分國(guó)家犬中感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究。在歐洲，Decaro等對(duì)1172份來(lái)自于2001～2008年期間犬腹瀉糞便樣品中CCoV進(jìn)行了調(diào)查，CCoV陽(yáng)性率為42.06%（493/1172），其中CCoV-I為7.94%（93/1172），CCoV-II為18.6%（218/1172），CCoV-I+II為15.53%（182/1172），CCoV-IIb為6.66%（78/1172）［13］。在西歐地區(qū)，Decaro等［14］報(bào)道，CCoV在犬腹瀉樣品中的陽(yáng)性率為38.46%（60/156），其中意大利為51.28%（20/39，CCoV-I（1），CCoV-II（10），CCoV-I+II（9）），比利時(shí)為80%（8/10，CCoV-I（2），CCoV-II（6）），荷蘭為60%（3/ 5，CCoV-I（1），CCoV-I+II（2）），德國(guó)為38.09%（8/21，CCoV-II（7），CCoV-I+II（1）），英國(guó)為12.5%（1/8，CCoV-II（1）），西班牙為36.17%（17/47，CCoV-II（10），CCoV-I+II（7）），法國(guó)為11.54%（3/26，CCoV-II（2），CCoV-I+II（1））；在60個(gè)CCoV陽(yáng)性樣品中，CCoV-I為40%（24/60），CCoV-II為93.33%（56/60），CCoV-I和CCoV-II共感染為33.33%（20/60）。在阿爾巴尼亞，Cavalli等［15］報(bào)道，CCoV在犬腹瀉糞便樣品中陽(yáng)性率為53.39%（31/57），其中CCoV-I陽(yáng)性率為33.33%（19/57），CCoV-II陽(yáng)性率為45.61%（26/57）；26個(gè)CCoV-II毒株亞型分析顯示，23個(gè)毒株屬于CCoV-IIa型，3個(gè)毒株屬于CCoV-IIb型［15］。在希臘，Ntafis等［16］報(bào)道，CCoV在腹瀉犬糞便樣品中陽(yáng)性率為65.1%，其中47%陽(yáng)性樣品存在CCoV一個(gè)以上型和亞型的共感染，包括CCoV-I/CCoV-IIa/CCoV-IIb共感染。

在中國(guó)，Wang等［17］報(bào)道，CCoV-II在健康犬和腹瀉犬糞便中的陽(yáng)性率分別為86.42%（70/81）和43.75%（21/48）；在健康狐貍糞便中，CCoV-I陽(yáng)性率為47.54%（29/61），CCoV-II陽(yáng)性率為70.49%（43/61），CCoV-I和CCoV-II共感染率為40.98%（25/61）；在貉糞便樣品中，CCoV-II陽(yáng)性率為91.67%（22/24）。Wang等［18］報(bào)道，CCoV在黑龍江地區(qū)犬腹瀉糞便中的陽(yáng)性率為28.36%（57/201），其中CCoV-I占15.79%（9/57），CCoV-II占84.21%（48/57）；CCoV-II亞型分析顯示，在28 CCoV毒株中，26個(gè)毒株屬于CCoV-IIa型。在日本，Soma等［19］報(bào)道，CCoV在腹瀉犬糞便樣品中的陽(yáng)性率為50.46%（55/109），其中CCoV-I占65.45%（36/55），CCoV-II占72.73%（40/55），CCoVI+II占40%（22/55）；Takano等［20］報(bào)道，在CCoV陽(yáng)性樣品中，CCoV-I占88.9%，CCoV-II占7.4%。在韓國(guó)，Jeoung等［21］對(duì)22個(gè)韓國(guó)CCoV分離株M基因進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)毒株分成四個(gè)進(jìn)化群，即韓國(guó)CCoV毒株群、CCoV-II和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）群、CCoV-I亞群和CCoV-I+II中間群。在土耳其，Yesilbag等［22］報(bào)道，CCoV在犬腹瀉糞便中陽(yáng)性率為15.56%（14/90），其中CCoV-I型毒株為35.71%（5/14）。在美國(guó)，Licitra等［23］報(bào)道，在11份CCoV陽(yáng)性樣品中，9份樣品為CCoV-II陽(yáng)性，其中5個(gè)樣品為CCoV-IIa，1個(gè)樣品為CCoV-IIb，其他3個(gè)樣品不能被分型。在巴西，Costa等［12］調(diào)查顯示，CCoV在腹瀉犬樣品中陽(yáng)性率為12%（30/250），其中CCoV-I陽(yáng)性率為3.2%（8/250），CCoV-II陽(yáng)性率為7.6%（19/250）；CCoV-II亞型分析顯示，在17個(gè)CCoV毒株中，9個(gè)毒株為CCoV-IIa，其中7個(gè)毒株與CCoV-I共感染。目前，有限的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，不同基因型的CCoV毒株在世界范圍犬群中均有報(bào)道，但是不同CCoV基因型毒株所占比率有所不同。在亞洲、歐洲、南美洲和北美洲地區(qū)中，CCoV-II是主要流行的基因型，但是，在個(gè)別地區(qū)，CCoV-I是主要流行的基因型。

2 犬冠狀病毒的重組與變異

冠狀病毒是一類(lèi)具有囊膜的RNA病毒，可感染動(dòng)物和人；依據(jù)其血清型和基因型特征，又可進(jìn)一步分為Alpha-、Beta-、Gamma-和Delta-冠狀病毒屬。自SARS-CoV和MERS-CoV爆發(fā)后，冠狀病毒重組與變異，尤其是冠狀病毒跨種傳播，成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［24］。冠狀病毒具有較高重組和突變的可能性，主要由于三個(gè)方面的因素［25］：首先，盡管冠狀病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14具有3’→5’核酸外切酶校對(duì)活性，但是，在病毒每一次復(fù)制過(guò)程中，病毒基因組每1個(gè)位點(diǎn)的突變率仍然能達(dá)到2.0×10-6，所以冠狀病毒的RNA依賴(lài)性的RNA聚合酶（RdRp）具有較低的保真度；其次，冠狀病毒具有一個(gè)使用轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS）模式的獨(dú)特RNA復(fù)制機(jī)制，即拷貝選擇（“copy choice”）機(jī)制，它能誘導(dǎo)冠狀病毒發(fā)生同源RNA重組；最后，冠狀病毒是RNA病毒中基因組最大的，容易發(fā)生異源重組，例如Beta-冠狀病毒A亞群成員具有來(lái)源于C型流感病毒的血凝素酯酶基因。

作為冠狀病毒科的一個(gè)成員，CCoV包括CCoVI和CCoV-II（a/b）基因型，因不同CCoV基因型毒株在犬體內(nèi)共感染等因素，近年來(lái)CCoV重組和變異毒株已被報(bào)道。由于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）與CCoV-II高的遺傳相似性以及兩病毒基因組中ORF3的存在，Lorusso等［26］推測(cè)，TGEV是通過(guò)病毒的跨種間傳播起源于CCoV-II型毒株。Decaro和Erles等［27-28］報(bào)道了可能來(lái)自于與TGEV S蛋白N-端重組的新CCoV-II分離株，即TGEV-like CCoV毒株，因此CCoV-II被分為CCoV-IIa和CCoV-IIb。Decaro等［13］在歐洲地區(qū)調(diào)查了TGEV-like CCoV亞型毒株分布，大約20%CCoV-II樣品含有TGEV-like亞型。Regan等［29］報(bào)道，在CCoV-I和CCoV-II型之間發(fā)生重組的毒株CCoV-A76，CCoV-A76毒株具有不同的宿主細(xì)胞嗜性。Licitra等［11］建議，CCoV-A76毒株作為CCoV-IIc亞型代表毒株。Terada等［30］報(bào)道，在日本，3個(gè)貓冠狀病毒II型（FCoV-II）毒株的出現(xiàn)是通過(guò)FCoV-I、CCoV-II和親本毒株之間的同源重組，試驗(yàn)結(jié)果支持致病性的FCoV出現(xiàn)由于貓和犬冠狀病毒的同源重組。這些報(bào)道表明，CCoV重組發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，CCoV各型之間，CCoV與FCoV之間，CCoV與TGEV之間，均存在著潛在重組的可能性。

3 展望

面對(duì)CCoV不同基因型混合存在以及CCoV重組和變異問(wèn)題，后續(xù)研究工作應(yīng)加強(qiáng)對(duì)CCoV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，揭示不同地區(qū)CCoV基因型分布情況，監(jiān)測(cè)CCoV重組和變異毒株，明確不同CCoV基因型毒株，尤其是重組或變異毒株的致病性。另外，針對(duì)CCoV新基因型和高致病性毒株的出現(xiàn)，在未來(lái)研究中應(yīng)使用新的CCoV變異毒株制備疫苗，解決傳統(tǒng)CCoV滅活疫苗針對(duì)變異毒株免疫保護(hù)效果不佳的問(wèn)題，進(jìn)而達(dá)到有效預(yù)防CCoV流行毒株的感染?？傊珻CoV已經(jīng)由高發(fā)病率、低死亡率的一般性腹瀉病，轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒浴⒁鬃儺惖娜c道傳染病病原，在未來(lái)研究中應(yīng)該高度重視。

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Update on Genotyping and Recombination of Canine Enteric Coronavirus

W ang Xinyu，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Canine coronavirus（CCoV）belongs to the genus Alphacoronavirus and species Alphacoronavirus-1 along with feline coronavirus（FCoV）and transmissible gastroenteritis virus of swine（TGEV）.CCoV infection causes the puppies suffer from nonfatal mild diarrheic，presents the characteristics of the high prevalence and low mortality rates，when it is mixed with other intestinal pathogen infection，it can lead high mortality rate of sick animals.Recently，as the constantly report of CCoV variation of highly pathogenic strains in European state，and the disease aroused widespread concern again.In order to know more about the canine corona virus genetic evolution，this study reviews of research progress of the canine corona virus genotypes and recombination，provides reference for further research of CCoV.

CCoV；genotype；variation

S815.4

A

1002-2090（2016）03-0028-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.006

2015-10-19

黑龍江省高校新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（1252-NCET-016）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2016-Y26）。

王欣宇（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

孫東波，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：dongbosun@126.com。