基于SSR技術(shù)的水稻DNA指紋圖譜構(gòu)建

趙雅楠，王穎，2，張東杰，沈琰，楊義杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)）

基于SSR技術(shù)的水稻DNA指紋圖譜構(gòu)建

趙雅楠1，王穎1，2，張東杰1，沈琰1，楊義杰1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)）

水稻是我國(guó)重要的糧食作物，具有種植面積大、分布范圍廣等特點(diǎn)，然而由于水稻的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，在新品育種、品種區(qū)分及質(zhì)量監(jiān)控等方面經(jīng)常出現(xiàn)問(wèn)題。SSR技術(shù)作為第二代分子標(biāo)記的典型代表，具有標(biāo)記數(shù)量豐富、定位精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，在水稻SSR指紋圖譜的構(gòu)建中提到不可替代的重要作用。該文主要綜述了基于SSR技術(shù)構(gòu)建的水稻DNA指紋圖譜，對(duì)其技術(shù)要點(diǎn)及其構(gòu)建意義進(jìn)行分析，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

SSR技術(shù)；水稻；DNA指紋圖譜

“民以食為天”體現(xiàn)出人類(lèi)與糧食作物的密切關(guān)系，水稻作為我國(guó)最重要的糧食作物，與人們的生活密不可分。近些年，我國(guó)水稻種植大面積推廣，隨著水稻產(chǎn)量的大幅度提高，一系列問(wèn)題也接踵而來(lái)，假冒偽劣稻米以次充好、新品育種難度大、雜種優(yōu)勢(shì)不明顯等都制約著我國(guó)水稻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，研究快速、準(zhǔn)確的品種鑒定技術(shù)，為水稻的遺傳多樣性分析及種質(zhì)資源鑒定等提供依據(jù)迫在眉睫?！癉NA指紋”的概念由英國(guó)遺傳學(xué)家Jefferys在1985年第一次提出，正式將“指紋”一詞引入到現(xiàn)代分子生物學(xué)中[1]，隨后DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。SSR技術(shù)作為第二代分子標(biāo)記的典型代表，具有數(shù)量豐富、定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是一種較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)，在水稻DNA指紋圖譜的構(gòu)建過(guò)程中起到不可替代的重要作用。

1 DNA指紋圖譜技術(shù)及分類(lèi)

DNA指紋圖譜是指在DNA水平上建立像人類(lèi)指紋一樣具有特異性、可以區(qū)別品種及個(gè)體間差異的圖譜，標(biāo)記數(shù)量多，不受外界環(huán)境及作物發(fā)育階段的影響，多態(tài)性高，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，且操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，提取出的DNA樣品可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，適用于仲裁性或者溯源性鑒定[2-5]。目前，DNA指紋圖譜技術(shù)可以分為RFLP、RAPD、AFLP、SSR四類(lèi)。

RFLP標(biāo)記由Grodzicker等創(chuàng)立于1975年，是研究最早的一類(lèi)分子標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記數(shù)量大，可以區(qū)別純合型基因或者雜合型基因，但操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，需要使用放射性同位素，有害人體健康[6-8]，因此限制了其在DNA指紋圖譜中的應(yīng)用；RAPD標(biāo)記由Williams和Welsh在1990年創(chuàng)立，靈敏度高，檢測(cè)成本低，只需要少量的DNA樣品即可，但存在基因遷移的可能性，因此重復(fù)性較差[9-11]；AFLP標(biāo)記由Zabeau在1993年創(chuàng)立，是一類(lèi)與PCR技術(shù)緊密結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，具有較好的重現(xiàn)性，適用范圍廣，但是試劑盒價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高，要求提取出的DNA純度極高，實(shí)驗(yàn)人員的工作難度較大，此外，AFLP技術(shù)已經(jīng)被一些國(guó)家申請(qǐng)專(zhuān)利，因此該技術(shù)在商業(yè)及生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣存在一定的限制性[12-15]。

SSR又稱(chēng)微衛(wèi)星序列，是在真核生物中普遍存在的一段由1-6個(gè)堿基組成的重復(fù)序列，大約每10～50 kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星[16-18]。SSR技術(shù)主要利用基因中SSR序列兩端具有保守性的特點(diǎn)為其設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或者濃度較高的瓊脂糖凝膠電泳以分析DNA的多態(tài)性。SSR標(biāo)記與PCR技術(shù)緊密結(jié)合，是當(dāng)前應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)，涉獵范圍最廣的新型DNA標(biāo)記技術(shù)，具有結(jié)果重復(fù)性好、可信度高、操作簡(jiǎn)便，成本低等特點(diǎn)。與此同時(shí)，目前有一部分作物的SSR序列已經(jīng)公布，可以供人們直接使用，并且隨著SSR位點(diǎn)的不斷開(kāi)發(fā)，該技術(shù)必將成為作物品種鑒定、指紋圖庫(kù)構(gòu)建等領(lǐng)域的中堅(jiān)力量[19]。

2 SSR標(biāo)記技術(shù)要點(diǎn)

SSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、遺傳信息完整、結(jié)果可信度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于水稻的DNA指紋圖譜構(gòu)建之中。水稻SSR指紋圖譜構(gòu)建主要經(jīng)過(guò)核心SSR引物篩選、DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物分離等步驟[20]。

2.1 SSR引物的獲取

SSR引物是兩段人工合成的寡核苷酸序列，PCR的過(guò)程中在特定位置與目的DNA互補(bǔ)，充當(dāng)核苷酸在聚合反應(yīng)時(shí)的起始點(diǎn)。傳統(tǒng)的水稻SSR引物獲取方法是在NCBI、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，近些年，隨著二代測(cè)序時(shí)代的到來(lái)，水稻SSR引物的開(kāi)發(fā)也有了新突破。二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、低成本、簡(jiǎn)單便捷等特點(diǎn)，可以將龐大、復(fù)雜的水稻基因組簡(jiǎn)化，通過(guò)分析基因組中個(gè)別具有代表性的小DNA片段進(jìn)而探索整個(gè)基因組特征，其中比較常見(jiàn)的是RAD-seq技術(shù)。該技術(shù)利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行處理，對(duì)獲得的小片段建庫(kù)、測(cè)序，最后檢索出片段中的SSR位點(diǎn)。Sun等[21]利用兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)水稻基因組進(jìn)行處理，得到25 000個(gè)DNA片段，采用Illumina GAⅡ讀取其中90%的片段，占該水稻全基因組的82%，讀取的重復(fù)片段為19%，證明簡(jiǎn)化基因組應(yīng)用于水稻種質(zhì)研究中是可行的。

2.2 DNA提取

水稻的DNA提取是構(gòu)建SSR指紋圖譜的基礎(chǔ)工作，在提取的過(guò)程中要盡可能的保證DNA的完整性，在避免受到有機(jī)溶劑、金屬離子以及其它核酸分子污染的基礎(chǔ)上，將蛋白質(zhì)、多糖以及酚類(lèi)等含量降低。目前常用的DNA提取法主要包括CTAB法、SDS法、DNA試劑盒提取法和磁珠法核酸純化法等。SDS法操作步驟少，操作簡(jiǎn)單快捷，但主要是針對(duì)蛋白質(zhì)含量較多的作物，不適用于水稻的提?。淮胖榉ê怂峒兓夹g(shù)自動(dòng)化程度高，可以減少手工操作程序，但目前很少應(yīng)用于植物DNA提取中。DNA試劑盒可以避免使用酚和氯仿，安全可靠且提取率高，但操作煩瑣，成本較高，其中CTAB法是目前應(yīng)用最多的DNA提取方法。趙國(guó)珍等[22]開(kāi)發(fā)出一種高效的水稻DNA提取方法，成本較低，提取一份樣品只需0.1元，操作快捷，每小時(shí)可完成近百個(gè)樣品的提取，設(shè)備要求低，可直接提取水稻干種子，特別適合水稻SSR研究。Wang等[23]開(kāi)發(fā)出一種以超聲波溫育為前處理的CTAB法提取水稻DNA，發(fā)現(xiàn)該法提取質(zhì)量和提取效率都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是上個(gè)世紀(jì)80年代產(chǎn)生，用于擴(kuò)增特定DNA的分子生物學(xué)技術(shù)。其原理主要是利用DNA在95℃的體外環(huán)境下會(huì)變成單鏈，在60℃時(shí)可以與引物結(jié)合，在70℃左右時(shí)可以使DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈，可完成DNA擴(kuò)增的特點(diǎn)。SSR-PCR體系中含有較多的影響因子，如DNA模板濃度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTPs濃度、退火溫度等都對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響十分明顯[24-26]，因此通常都要進(jìn)行PCR條件的探索和優(yōu)化，探究同一PCR體系下各個(gè)影響因子的最佳配比。近些年，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，SSR-PCR技術(shù)也得到優(yōu)化，逐漸向操作簡(jiǎn)便、快捷高效的趨勢(shì)發(fā)展。羅天寬[27]等研究出一種應(yīng)用水稻葉片直接PCR的方法，省去了DNA的提取過(guò)程，直接以葉片為模板，加入0.8%PCR增強(qiáng)劑，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)效果與傳統(tǒng)PCR差異不顯著。魏霜等[28]對(duì)水稻的多重PCR反應(yīng)進(jìn)行研究，成功建立了七重PCR體系，發(fā)現(xiàn)相較于單一PCR體系，多重PCR檢測(cè)速度快，效率高，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.4 產(chǎn)物分離

PCR產(chǎn)物分離是SSR技術(shù)中難度較大的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)后續(xù)的數(shù)據(jù)處理、結(jié)果分析等起到重要作用。目前在水稻SSR指紋圖譜構(gòu)建中常用的分離技術(shù)主要包括瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法。瓊脂糖凝膠電泳可分離分子量在0.2～20 kb范圍內(nèi)的DNA分子，操作簡(jiǎn)便，不需預(yù)處理，可直接在紫外光下觀(guān)察條帶情況[29]，但在制膠過(guò)程中需要使用具有致癌性的溴化乙錠，有害人體健康，且瓊脂糖的分辨率不高，在引物篩選及品種鑒定方面效果不佳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離分子量在1～500 bp的核苷酸片段，其分辨率高于瓊脂糖凝膠，但仍不能準(zhǔn)確讀取DNA片段的大小，易出現(xiàn)誤讀，且操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，不適合大規(guī)模、多批次的處理樣品[30]。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法是一種高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)，能夠識(shí)別1～2個(gè)堿基片段之間的差異，是目前較先進(jìn)的產(chǎn)物分離技術(shù)。程本義[31]等以16份雜交水稻為模板建立SSR熒光標(biāo)記體系，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)，結(jié)果可靠，檢測(cè)效率和質(zhì)量俱佳。

3 SSR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)與不足

SSR標(biāo)記作為第二代分子標(biāo)記技術(shù)的典型代表，較于其他分子標(biāo)記技術(shù)具有十分突出的優(yōu)點(diǎn)。首先，SSR標(biāo)記以核酸為研究單位，能夠在DNA水平上評(píng)價(jià)個(gè)體或種群之間的差異，不受周?chē)h(huán)境、采樣時(shí)間、DNA來(lái)源組織或器官的影響，不涉及基因是否表達(dá)等問(wèn)題。其次，植物中的SSR數(shù)量豐富，分布廣泛，能夠開(kāi)發(fā)的標(biāo)記幾乎是無(wú)限的。第三，SSR標(biāo)記符合孟德?tīng)柖?，呈共顯性，能夠區(qū)分純合型或雜合型基因。最后，SSR標(biāo)記對(duì)DNA純度及數(shù)量要求不高，即使部分DNA降解也可以完成分析[32-36]。由此可見(jiàn)，SSR標(biāo)記的優(yōu)越性十分明顯，但同時(shí)也存在一定的局限性。首先，由于SSR的進(jìn)化具有不確定性，DNA分子的突變機(jī)理及突變方向仍飽受爭(zhēng)議，尚未探究清楚，需要根據(jù)不同品種設(shè)計(jì)不同的特異性引物。其次，部分SSR標(biāo)記位點(diǎn)與功能位點(diǎn)存在不同程度的差異，這種不一致使分子標(biāo)記與目的基因之間存在一定的遺傳距離，進(jìn)而會(huì)在后續(xù)的分子輔助選擇中出現(xiàn)一定的不準(zhǔn)確。最后，由于SSR技術(shù)起步較晚，有很多與控制重要農(nóng)藝形狀目的基因相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記還沒(méi)有準(zhǔn)確定位，這在一定程度上影響了分子標(biāo)記的質(zhì)量[37-39]。

4 展望

SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在水稻的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等領(lǐng)域體現(xiàn)出重要應(yīng)用價(jià)值?；赟SR技術(shù)構(gòu)建水稻DNA指紋圖譜是分子標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展的標(biāo)志，是快速、準(zhǔn)確鑒定常規(guī)水稻真實(shí)性及純度的重要技術(shù)體系，是保護(hù)稻米種權(quán)、拓寬水稻遺傳基礎(chǔ)的必經(jīng)之路。隨著水稻基因組測(cè)序工作的快速推進(jìn)，越來(lái)越多的滿(mǎn)足SSR標(biāo)記的等位基因位點(diǎn)將會(huì)呈現(xiàn)在人們面前。此外，熒光素標(biāo)記法、毛細(xì)管電泳技術(shù)等也逐漸成熟，對(duì)水稻SSR指紋圖譜的應(yīng)用起到巨大推動(dòng)作用。毋庸置疑，水稻SSR指紋圖譜技術(shù)的不斷發(fā)展必然會(huì)為水稻的基因組研究、品種真?zhèn)舞b定、遺傳分析等提供有力支持，因此，水稻SSR指紋圖譜意義重大，值得大力推廣。

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Fingerprint Construction of Rice DNA Based on the SSR Molecular Marker Technology

Zhao Yanan1，Wang Ying1，2，Zhang Dongjie1，Shen Yan1，Yang Yijie1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy）

Rice was one of the most important crops in China，with large planting area，and wide geographical distribution scope. However，for the narrow genetic basis，problems always emerged in new variety breeding，quality control and other aspects of distinction.SSR technology typically presented the 2nd generation of molecular marking，had the advantages of large amount，spicific location plays an irreplaceable role in SSR fingerprint construction.The article reviewed the recent development of DNA fingerprint construction based on SSR technology.Key technology elements and significance of fingerprint construction，and new trend of this area was also discussed.

SSR；rice；DNA fingerprint

S511

A

1002-2090（2016）05-0032-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.006

2015-09-28

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B02）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開(kāi)發(fā)重大項(xiàng)目（GA14B104）；黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（高產(chǎn)金屬硫蛋白菌株的選育及其高效純化技術(shù)研究：HNK125B-13-05）；大慶科技局創(chuàng)新項(xiàng)目（雜糧及其深加工分析測(cè)試技術(shù)平臺(tái)建設(shè)：sjh-2013-65）。

趙雅楠（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2015級(jí)碩士研究生。

張東杰，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：byndzdj@126.com。