粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的抑菌防病作用

楊蕊,郎劍鋒,陸寧海,石明旺

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的抑菌防病作用

楊蕊,郎劍鋒,陸寧海,石明旺

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

為研究粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的抑菌防病作用,采用PDA平板和水瓊脂對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定粉紅粘帚霉的抑菌作用,采用扣皿法測(cè)定揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用,采用含毒介質(zhì)法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌作用,測(cè)定孢子液對(duì)玉米種子的促生作用,通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測(cè)定粉紅粘帚霉的苗期防病效果.結(jié)果表明：粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病具有生防潛力.病菌菌落擴(kuò)展受到明顯抑制,粉紅粘帚霉菌絲重寄生病菌菌絲,導(dǎo)致菌絲細(xì)胞原生質(zhì)顆?；⒔?；揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用；JM發(fā)酵濾液對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用,且第9天的抑菌活性最好,菌絲生長(zhǎng)抑制率為50%；孢子液可以在一定程度上提高種子萌發(fā)率和單株鮮質(zhì)量；粉紅粘帚霉對(duì)苗期玉米莖基腐病具有一定的防病效果.

粉紅粘帚霉；禾谷鐮刀菌；生物防治

玉米莖基腐?。╟orn stalk rot）,又稱(chēng)青枯病,由多種病原菌侵染引起,可造成玉米根系和莖基腐爛,一般年份發(fā)病率10%～20%,嚴(yán)重年份可達(dá)50%～60%[1].近年來(lái),由于推廣品種普遍對(duì)莖基腐病的抗性水平較低,以及秸稈還田技術(shù)的推廣,造成田間病原菌的積累,玉米莖基腐病在河南省發(fā)病情況逐漸加重[2-3].

玉米莖基腐病病原復(fù)雜[4-5],生產(chǎn)上主要采用以抗病品種為中心的農(nóng)業(yè)防治措施,由于推廣的主栽品種抗性水平普遍較低,應(yīng)用生物防治手段防治該病害日益受到人們的重視[6].已報(bào)道的玉米莖基腐病生防菌以細(xì)菌居多[7],對(duì)于其生防真菌的研究報(bào)道相對(duì)較少,生防真菌主要有球毛殼霉（Chaetomium globosum）、木霉屬（Trichoderma spp）、綠粘帚霉（Gliocladium virens）CH-3等[8-9].粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）是一種重要的重寄生真菌,寄主范圍廣,開(kāi)發(fā)潛力大[10].粉紅粘帚霉用于灰霉病、菌核病和水稻紋枯病的防治效果明顯[11-14],而對(duì)于利用此生防菌防治玉米莖基腐病,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.因此,很有必要評(píng)估粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的生防潛力.本研究以禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為指示菌,對(duì)粉紅粘帚霉的抑菌作用、促生作用、苗期防病潛力等進(jìn)行了初步研究,旨在為玉米莖基腐病生防菌劑的研發(fā)和應(yīng)用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株供試粉紅粘帚霉菌株（C.rosea）和病原禾谷鐮刀菌（F.graminearum）菌株均由河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供.

1.1.2 供試培養(yǎng)基本研究中使用的培養(yǎng)基配方如下：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextrose agar,簡(jiǎn)稱(chēng)PDA）：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL,121℃滅菌25 min備用[15].

JM液體培養(yǎng)基：淀粉30 g/L,蛋白胨2 g/L,蒸餾水1 000 mL[16].

水瓊脂培養(yǎng)基（water agar,簡(jiǎn)稱(chēng)WA）：瓊脂條20 g,蒸餾水1 000 mL[17].

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粉紅粘帚霉對(duì)病菌的抑制作用采用平板對(duì)峙法,測(cè)定粉紅粘帚霉對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌作用.取新鮮培養(yǎng)的粉紅粘帚霉菌餅（直徑5 mm）接種至PDA平板（直徑9 cm）,4 d后接種病菌菌餅,菌餅中心相距5 cm,以僅接病菌平板為對(duì)照,3次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d,逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況并鏡檢病菌菌絲生長(zhǎng)情況.

將水瓊脂培養(yǎng)基（WA）倒入放有無(wú)菌載玻片的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)基的厚度以剛好覆蓋住載玻片為好,在載玻片上形成水瓊脂膜.載玻片一端先接種粉紅粘帚霉菌餅（直徑5 mm）,3 d后,載玻片另一端接種病菌菌餅,6次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng),待兩種菌菌絲接觸后,取出載玻片光學(xué)顯微鏡下逐日觀察重寄生情況.

1.2.2 粉紅粘帚霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用采用扣皿法[18],將活化2 d的粉紅粘帚霉菌餅（直徑5 mm）接種至PDA平板（直徑9 cm）上,放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待其菌落直徑長(zhǎng)到5 cm時(shí),在上方蓋上雙層圓形無(wú)菌濾紙（直徑10 cm）,再在濾紙上方扣上接種了病菌菌餅的PDA平板（撤去培養(yǎng)皿蓋,直徑9 cm）.并用透明膠帶將兩皿固定密封好,下層為粉紅粘帚霉平板,上層為病菌平板.以未接種粉紅粘帚霉的PDA平板和只接種病菌的平板對(duì)扣處理為對(duì)照,3次重復(fù).22℃恒溫培養(yǎng),逐日測(cè)量病原菌菌落直徑.

1.2.3 粉紅粘帚霉發(fā)酵液的抑菌作用JM液體培養(yǎng)基搖培粉紅粘帚霉,每瓶接種3個(gè)菌塊（直徑5 mm）, 150 r/min,30℃振蕩培養(yǎng).分別在培養(yǎng)6 d、9 d、12 d后取樣,培養(yǎng)物經(jīng)2層擦鏡紙過(guò)濾,濾液3 000 r/min離心15 min,上清液分別經(jīng)0.45 μm、0.22 μm濾膜過(guò)濾,收集濾液,-20℃保存?zhèn)溆?配制體積分?jǐn)?shù)為20%的發(fā)酵液,測(cè)定其對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響.方法如下：4 mL發(fā)酵液+16 mL PDA融合成含藥平板.將病菌菌餅（直徑5 mm）接種于平板中心,以4 mL無(wú)菌水+16 mL PDA混合均勻倒平板為對(duì)照,3次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng),3 d后測(cè)定病菌菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率.

1.2.4 粉紅粘帚霉對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響用粉紅粘帚霉分生孢子懸浮液（每mL含孢子1.0×107個(gè)）浸泡玉米種子2 h,晾干,移入鋪有無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),對(duì)照組種子用無(wú)菌水浸泡,每皿10粒,3次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng)7 d后,測(cè)量玉米種子的發(fā)芽率及幼苗的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量.

1.2.5 苗期防病效果測(cè)定將接種病菌的麥粒培養(yǎng)基與無(wú)菌土按照質(zhì)量比1∶20的比例混合均勻,置于營(yíng)養(yǎng)缽中,然后將不同處理的玉米種子播種在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi),每缽10粒玉米種子,每處理5個(gè)缽.4個(gè)處理分別為粉紅粘帚霉孢子液（每mL含孢子7.5×107個(gè)）浸種4 h,粉紅粘帚霉9 d發(fā)酵液浸種4 h,敵委丹藥劑拌種（藥劑與種子質(zhì)量比為1∶167～200）,敵委丹稀釋液浸種4 h（每kg種子含敵委丹有效成分3.38 g）.以無(wú)菌水浸泡4 h為對(duì)照,3次重復(fù).待玉米苗長(zhǎng)到4～5葉期,調(diào)查病情[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 粉紅粘帚霉對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

粉紅粘帚霉對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)圖1,對(duì)禾谷鐮刀病菌的重寄生作用見(jiàn)圖2.

由圖1可知,PDA平板對(duì)峙試驗(yàn)中,粉紅粘帚霉對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用.對(duì)峙培養(yǎng)3 d后,對(duì)照病菌菌落平均半徑達(dá)到57.7 mm,而處理病菌菌落平均半徑為33.0 mm,t檢驗(yàn)結(jié)果表明,處理與對(duì)照間存在極顯著性差異（P＜0.01）.

由圖2可知,PDA對(duì)峙平板上,病菌菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),粉紅粘帚霉菌落逐步覆蓋病菌菌落.光學(xué)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn),粉紅粘帚霉對(duì)病菌具有重寄生作用.對(duì)照平板上,病菌菌絲質(zhì)地均勻,分支正常；而處理平板上,粉紅粘帚霉菌絲平行延伸、纏繞并穿透病菌菌絲,受到粉紅粘帚霉重寄生作用的病菌菌絲發(fā)生潰解,分支出現(xiàn)異常,菌絲細(xì)胞原生質(zhì)顆粒化、外滲.

2.2 粉紅粘帚霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用

粉紅粘帚霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1.

由表1可知,粉紅粘帚霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定試驗(yàn)中,共培養(yǎng)1 d,對(duì)照病原菌菌落直徑為16.2 mm,處理病原菌菌落直徑為17.3 mm,對(duì)照與處理間差異不顯著；共培養(yǎng)2 d,對(duì)照菌落直徑為37.8 mm,處理菌落直徑為39.7 mm,差異不顯著；共培養(yǎng)3 d,對(duì)照菌落直徑為56.2 mm,處理菌落直徑為55.2 mm,差異不顯著；共培養(yǎng)4 d,對(duì)照菌落直徑為76.8 mm,處理菌落直徑為82.7 mm,差異顯著.表明粉紅粘帚霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用.

2.3 粉紅粘帚霉發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用

粉紅粘帚霉JM培養(yǎng)物濾液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3.

由圖3可知,在JM培養(yǎng)基搖培6 d后,培養(yǎng)液中未檢測(cè)到抑菌活性.從第6天至第9天,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌活性呈上升趨勢(shì),第9天培養(yǎng)液的菌絲生長(zhǎng)抑制率為50%,之后,培養(yǎng)液的抑菌活性下降,至第12天,培養(yǎng)液的抑菌活性為16%.對(duì)照與各處理間的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）.

2.4 粉紅粘帚霉對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響

粉紅粘帚霉對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表2.

由表2可知,粉紅粘帚霉對(duì)玉米種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用.玉米種子經(jīng)粉紅粘帚霉分生孢子液浸泡處理后,對(duì)照萌發(fā)率為85%,處理萌發(fā)率為86.3%,對(duì)照與處理之間無(wú)顯著差異；對(duì)照芽長(zhǎng)為7.7 mm,處理芽長(zhǎng)為6.8 mm,對(duì)照與處理之間差異不顯著；對(duì)照根長(zhǎng)為31.3 mm,處理根長(zhǎng)為30.4 mm,對(duì)照與處理間無(wú)顯著差異.對(duì)照單株鮮質(zhì)量為0.64 g,而處理單株鮮質(zhì)量為0.66 g,對(duì)照與處理之間存在顯著差異（P＜0.05）.

2.5 粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的苗期防病效果

粉紅粘帚霉及敵萎丹等對(duì)玉米莖基腐病的苗期防病效果見(jiàn)圖4.

由圖4可知,粉紅粘帚霉JM發(fā)酵液和分生孢子液對(duì)禾谷鐮刀菌侵染玉米具有一定的抑制作用.表現(xiàn)在粉紅粘帚霉JM發(fā)酵液和分生孢子液處理病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照處理（P＜0.05）.對(duì)照病情指數(shù)為64,粉紅粘帚霉發(fā)酵液處理病情指數(shù)為59,粉紅粘帚霉孢子液處理病情指數(shù)為56.9,敵萎丹藥劑浸種處理病情指數(shù)為53.3,敵萎丹藥劑拌種處理病情指數(shù)為51.1,5個(gè)處理間存在顯著性差異.由試驗(yàn)結(jié)果可看出,粉紅粘帚霉孢子液處理的效果要好于JM發(fā)酵液處理,但低于藥劑處理對(duì)病菌侵染的抑制效果.

3 結(jié)論與討論

粉紅粘帚霉對(duì)多種植物病原菌都有很強(qiáng)的抑制作用,其生防機(jī)制主要包括拮抗、重寄生和誘導(dǎo)植物抗性,開(kāi)發(fā)潛力巨大.本試驗(yàn)結(jié)果表明,粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病病菌禾谷鐮刀菌具有明顯的抑制作用.平板對(duì)峙試驗(yàn)中,粉紅粘帚霉菌落寄生禾谷鐮刀菌菌落,使其菌落擴(kuò)展受到抑制.重寄生是粉紅粘帚霉重要的生防機(jī)理,菌絲顯微觀察也發(fā)現(xiàn),粉紅粘帚霉菌絲重寄生禾谷鐮刀菌菌絲,導(dǎo)致其菌絲出現(xiàn)生長(zhǎng)異常、潰解.扣皿試驗(yàn)結(jié)果表明,揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用.粉紅粘帚霉發(fā)酵液可抑制水稻紋枯病菌菌絲的生長(zhǎng)[13,20].本試驗(yàn)結(jié)果也表明,粉紅粘帚霉JM培養(yǎng)物濾液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用.環(huán)境pH值可調(diào)控真菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,試驗(yàn)中粉紅粘帚霉JM培養(yǎng)物濾液抑菌活性隨培養(yǎng)時(shí)間而變化,共培養(yǎng)9d抑菌活性最高,隨后下降,這是否與環(huán)境pH值調(diào)控有關(guān),還有待于進(jìn)一步研究.

粉紅粘帚霉能夠提高水稻發(fā)芽率,促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)[13],對(duì)番茄種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用[21].本試驗(yàn)結(jié)果表明,粉紅粘帚霉對(duì)玉米種子具有促生作用,其孢子液可以在一定程度上提高種子萌發(fā)率和單株鮮質(zhì)量.玉米苗期防效試驗(yàn)結(jié)果表明,粉紅粘帚霉對(duì)玉米苗期禾谷鐮刀菌的侵染具有明顯的抑制作用.無(wú)論是發(fā)酵液還是孢子液均在一定程度上減輕病害的發(fā)生,相比較而言,孢子液的防病效果要好于發(fā)酵液.因此,利用粉紅粘帚霉防治玉米莖基腐病具有一定的開(kāi)發(fā)潛力.

粉紅粘帚霉作為微生物生防制劑,其防效受到寄主、環(huán)境條件及施用方式等多方面的影響.本研究結(jié)果表明,粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病具有生防潛力,尤其是重寄生機(jī)制方面.今后,將進(jìn)一步展開(kāi)粉紅粘帚霉菌株的施用方式、在土壤中消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)以及生防菌與病原菌的互作等方面的研究,以期為挖掘玉米莖基腐病生防資源及其應(yīng)用提供理論依據(jù).

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Inhibition and protective activities of Clonostachys rosea to corn stalk rot

YANG Rui,LANG Jianfeng,LU Ninghai,SHI Mingwang
（Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China）

The article aimed to evaluate the efficacy of Clonostachys rosea in suppression of corn stalk rot caused by Fusarium graminearum.Confrontation culture in PDA and WA（water agar）plate were used to test the inhibitory effect of C.rosea on mycelial growth of F.graminearum.Dish buckle and Toxic media was used to test the inhibitory effect of volatile metabolites and cultural filtrates,respectively.Conidia solution was used to test the growth-promoting effect on corn seed.The efficacy of C.rosea in suppression of the infection by F.graminearum was tested by indoor pot experiment.The results showed that C.rosea can be potentially exploited as an agent to control corn stalk rot.The colony expansion of F.graminearum was inhibited in confrontation culture plates,and the hyphae were parasitised by C.rosea.The inhibited mycelia of F.graminearum showed severe abnormal symptoms including cytoplasma granulation and outward leakage,cellular swelling and collapse.No inhibitory effect on mycelial growth of F. graminearum was observed by volatile metabolites of C.rosea.The mycelial growth of F.graminearum were suppressed by the JM cultural filtrate,especially on 9th day,mycelial growth inhibition rate was 50%.The germination of seed and plant fresh weight were promoted by conidia solution of C.rosea to a certain degree.C.rosea was some effective in suppression of F.graminearum in the seedling stage.

Clonostachys rosea；Fusarium graminearum；biological control

S476

A

1008-7516（2016）05-0028-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.05.006

2016-08-12

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13B210012）；河南科技學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（06030）

楊蕊（1980―）,女,河南新鄉(xiāng)人,碩士,講師.主要從事植物病害生物防治方面的研究.