SCP-2基因的表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展

張麗麗，喬 利，梁麗寧，趙 茹，宋新強(qiáng)*

(1.信陽師范學(xué)院 a.生命科學(xué)學(xué)院；b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽 464000；2.信陽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000；3. 華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510631)

0 引言

固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SCP-2)是一類非特異性脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中.該蛋白最初被認(rèn)為參與線粒體中羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為膽固醇，它促進(jìn)膽固醇代謝中的多個(gè)步驟，參與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)之間膽固醇、糖脂、磷脂以及膽固醇?xì)溥^氧化物運(yùn)輸，膽固醇酯化和儲(chǔ)存[1]，甾類激素合成[2-3].此外，SCP-2還有可能參與調(diào)節(jié)質(zhì)膜上脂筏/胞膜窖的脂質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和功能，并參與其中的脂類代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4].人SCP-2蛋白還可以進(jìn)入細(xì)胞核，與γ分泌酶(Alzheimer disease γ-secretase)基因CD147的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，調(diào)控該基因的表達(dá)，并增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而參與老年癡呆癥的形成和發(fā)展[5].另有研究表明SCP-2蛋白在抵抗脂肪酸過氧化方面發(fā)揮重要作用[6].SCPx/pro-SCP-2蛋白的異常表達(dá)可能引起多種疾病，如糖尿病、動(dòng)能力脈硬化、Alzheimer病、尼曼氏病(類脂組織細(xì)胞增多癥)、格式癥(腎綜合征)、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等[7].

SCPx蛋白是一個(gè)雙功能蛋白，N端是SCP-t，C端是SCP-2，它具有硫解酶活性，參與支鏈脂肪酸氧化，又是固醇類和脂類運(yùn)輸載體，然而N端硫解酶的存在使SCPx與膽固醇和脂類結(jié)合顯著降低[8].昆蟲體內(nèi)不含膽固醇從頭生物合成所需的兩種關(guān)鍵酶——羊毛甾醇合酶和鯊烯合酶，但可以將從植物中吸收的谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇在中腸中轉(zhuǎn)化為膽固醇,作為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的組成成分和蛻皮激素20E合成的前體物質(zhì)[9].因此食物中固醇類物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是昆蟲體內(nèi)重要的生理過程.在埃及伊蚊(Aedesaegpti)、棉鈴蟲(Helicoverpazea)、家蠶(Bombyxmori)以及斜紋夜蛾(Spodopterallitura)中，SCPx在幼蟲中腸表達(dá)水平最高[10-13]，推測(cè)與固醇類物質(zhì)的吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān).

SCPx基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)很復(fù)雜的過程，在不同的物種及不同組織，甚至同種物種的不同性別中，SCPx基因的表達(dá)水平相差很大.如雞肝臟中SCPx和pro-SCP-2的mRNA含量卻比雄性高很多[14]，雌性的大鼠和小鼠肝臟中SCPx蛋白的含量比同齡雄性低很多[15].而且mRNA水平和蛋白水平并不完全一致，如大鼠心臟和肺中SCP-2 mRNA水平很高，但蛋白含量卻很低；SCPx蛋白水平則與mRNA水平相一致[15].本文主要介紹SCP-2基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展.

1 SCP-2基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展

基因的表達(dá)調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，是由基因組中順式調(diào)控元件與反式作用因子共同作用決定，反式作用因子結(jié)合到順式調(diào)控元件上發(fā)揮作用[16].已知的反式作用因子分三類：(1) 普通轉(zhuǎn)錄因子.主要參與基因的基礎(chǔ)表達(dá).這是在多數(shù)細(xì)胞中普遍廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子.它們多參與RNA Polymerase l 的轉(zhuǎn)錄起始作用,如TATA盒結(jié)合因子TFID、GC盒結(jié)合因子SP1等.(2)組織特異性轉(zhuǎn)錄因子.基因表達(dá)的組織特異性在很大程度上取決于組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的存在.RASHNE等認(rèn)為,組織特異性轉(zhuǎn)錄因子區(qū)別于廣泛轉(zhuǎn)錄因子在于,它在結(jié)構(gòu)上常常只具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域兩者其中之一,因此它僅在那些提供了其缺失部分功能的細(xì)胞中發(fā)揮作用.(3)誘導(dǎo)性反式作用因子.這些反式作用因子的活性可被特異的誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo).這種活性的誘導(dǎo)可以是新蛋白質(zhì)的合成，也可是已存在的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾.如，AMP結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子XRE B、類固醇激素受體等[16].

目前已經(jīng)得到了啟動(dòng)子序列的SCPx和SCP-2基因有：人[17]和大鼠[18]的SCPx和SCP-2基因及埃及伊蚊的SCP-2基因[19]，它們的共同特征是缺少TATA框，但含有GC富集區(qū)，這是哺乳動(dòng)物編碼過氧化物酶體蛋白的共同特征[17].TATA框通常與RNA聚合酶牢固結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始，該位點(diǎn)誘導(dǎo)突變后，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能發(fā)生改變.比如，人的SCPx基因有兩個(gè)啟動(dòng)子分別調(diào)控SCPx和SCP-2的表達(dá)，第一個(gè)啟動(dòng)子大致位于SCPx第一個(gè)外顯子處，含有SP1，激活蛋白1(AP1)，激活蛋白-2(AP-2)，雌激素反應(yīng)元件(ERE)，NBFI 反應(yīng)元件(NBRE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)，SCP-2啟動(dòng)子位于SCPx下游第11個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，也含有AP1，AP2，ERE，NFκB，MRE反應(yīng)元件[17].大鼠SCPx啟動(dòng)子區(qū)推測(cè)含有糖皮質(zhì)激素受體元件(GRE)，AP2，類固醇生成因子(SF-1)，細(xì)胞核因子-Y(NF-Y)，CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)，酸性乳清蛋白(WAP)，cAMP，胰島素，過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)和雌激素的反應(yīng)元件AP2[18].調(diào)控元件依賴其上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達(dá).

2 激素和環(huán)境因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)SCP-2基因表達(dá)的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在調(diào)控元件上調(diào)控基因的表達(dá)，通常需要激素和外界環(huán)境因子的輔助發(fā)揮作用.大多數(shù)真核生物的基因調(diào)控信號(hào)常常來自于體內(nèi)的各種激素.促腎上腺皮質(zhì)激素和促性腺激素可以通過cAMP上調(diào)SCPx和SCP-2基因mRNA的表達(dá)[20]，從而促進(jìn)甾類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成[21].經(jīng)過促性腺激素處理的大鼠，其體內(nèi)SCP-2基因表達(dá)也增加了幾倍[22].注射類固醇激素雌二醇到公雞體內(nèi)，能導(dǎo)致SCP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平提高2倍[14-15].抑制甾類激素生成的物質(zhì)前列腺素則抑制SCP-2基因的表達(dá)[23].在昆蟲體內(nèi)，培養(yǎng)的昆蟲中腸組織中加入蛻皮激素(20E)12小時(shí)后，AeSCP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高了2倍，這說明20E能正向調(diào)節(jié)促進(jìn)AeSCP-2基因的轉(zhuǎn)錄[10,24].

除激素以外，還有各種營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因子發(fā)生反應(yīng)時(shí)刺激基因表達(dá).促腎上腺皮質(zhì)激素和促性腺激素誘導(dǎo)SCP-2和SCPx基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)固醇類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過cAMP和SF-1這類環(huán)境因子來實(shí)現(xiàn)的[20-21].在患糖尿病的大鼠體內(nèi)，SCPx蛋白水平升高，SCP-2蛋白含量下降有關(guān)，補(bǔ)充胰島素后SCPx和SCP-2蛋白水平恢復(fù)正常[23]，表明SCPx和SCP-2蛋白的表達(dá)水平受體內(nèi)胰島素水平的調(diào)控.糖尿病患者體內(nèi)高水平的脂肪酸和三酰甘油可能通過促進(jìn)PPARα和RXR結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)PPRE反應(yīng)元件上，促進(jìn)SCPx基因表達(dá)，SCPx蛋白水平升高[18].用連有人SCPx和SCPx-2啟動(dòng)子的報(bào)告基因分別轉(zhuǎn)染BeWo絨毛膜癌細(xì)胞，HepG2 肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞，小鼠Y1 腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞和Balb 3T3 成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在不同的宿主細(xì)胞中基因的本底表達(dá)水平不同[17].8-Br-cAMP和佛波酯可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)SCPx控制下報(bào)告基因的表達(dá)，而不影響SCP-2基因啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因表達(dá)量[21].這表明SCPx和SCP-2基因的表達(dá)以及對(duì)藥物的響應(yīng)與細(xì)胞的種類有關(guān)，且它們的表達(dá)調(diào)控以不同的方式進(jìn)行.另有研究表明，在氧脅迫條件下，forkhead蛋白FOXO3a結(jié)合到SCP-2基因啟動(dòng)子區(qū)，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[6].但是也有研究表明，大鼠肝臟中的SCPx-2、SCPx蛋白水平不受喂食膽固醇、饑餓/再喂食、或者喂食降膽固醇藥物如消膽胺、洛伐他汀的影響[15].SF-1作為一種類固醇生長(zhǎng)因子，與昆蟲蛻皮激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子βFTZ-F1同源[20].在哺乳動(dòng)物中，促腎上腺皮質(zhì)激素和促性腺激素也可以通過SF-1上調(diào)SCPx和SCP-2基因mRNA的表達(dá)[24]，從而促進(jìn)甾類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成[21].埃及伊蚊中SCPx和SCP-2分別由獨(dú)立的基因編碼[10]，這兩個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控方式可能有所不同.在埃及伊蚊中，20E可以誘導(dǎo)幼蟲中腸組織中AeSCP-2基因的表達(dá)有瞬時(shí)誘導(dǎo)作用，這與20E下游轉(zhuǎn)錄因子HR-3有關(guān)[10,19].轉(zhuǎn)錄因子βFTZ-F1不能上調(diào)AeSCP-2基因表達(dá)[19].哺乳動(dòng)物和昆蟲調(diào)控SCP-2基因表達(dá)的機(jī)制不同，這可能與昆蟲缺乏自身膽固醇合成通路有關(guān).AeSCP-2基因同時(shí)受死亡相關(guān)蛋白(Thanatos-associated protein, THAP)和激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor-2, TAF-2)的拮抗調(diào)控，但尚不清楚它們的作用是否受20E誘導(dǎo)[25].

3 斜紋夜蛾SCP-2基因的表達(dá)調(diào)控研究

由于固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是蛻皮激素合成前體膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，缺乏該蛋白昆蟲將不能正常吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，嚴(yán)重影響幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育.因此對(duì)固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控研究對(duì)于研究昆蟲膽固醇的吸收運(yùn)輸和蛻皮激素生物合成以及與此相關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育過程的機(jī)理研究有著重要的意義.目前對(duì)SCP-2蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要在脊椎動(dòng)物進(jìn)行，但是對(duì)昆蟲SCP-2表達(dá)調(diào)控的研究較少，雙翅目的埃及伊蚊除含有SCPx外還有獨(dú)立和SCP-2基因和類SCP-2基因，THAF和ATF-2蛋白可能參與AeSCP-2的表達(dá)調(diào)控，但其作用途徑并不是很清楚[25].鱗翅目昆蟲SCP-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚無研究.近年來我們就鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾SCPx基因(SlSCPx)進(jìn)行了初步的研究[26].

3.1 昆蟲激素和脂類物質(zhì)處理對(duì)SlSCPx基因表達(dá)的影響

20E和保幼激素類似物methoprene 處理Spli-221細(xì)胞后，檢測(cè)SlSCPx和SlSCP-2 mRNA表達(dá)水平的的變化.結(jié)果表明，在0.5，2.0和8.0 μM的20E處理Spli-221細(xì)胞8，16和24 h后，SlSCPx和SlSCP-2的mRNA水平均沒有顯著變化.這與埃及伊蚊激素處理細(xì)胞后AeSCPx和AeSCP-2的mRNA水平結(jié)果一致[20].該研究中所使用的Spli-221細(xì)胞為斜紋夜蛾胚胎細(xì)胞，推測(cè)它的內(nèi)部環(huán)境可能導(dǎo)致了SlSCP-2 mRNA水平不受20E處理的影響，機(jī)體對(duì)膽固醇的需求是通過SCPx基因的基礎(chǔ)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[26].

向6齡白頭期斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)注射dsRNA，敲減SlSCPx基因表達(dá)，2天或3天之后血淋巴內(nèi)膽固醇濃度明顯降低；在Spli-221細(xì)胞中超表達(dá)SlSCPx或SlSCP-2可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量[13].埃及伊蚊AeSCP-2蛋白對(duì)膽固醇有很高的親和力(Kd =5.5±0.6×10-9M)[10].熒光取代實(shí)驗(yàn)表明，花生四烯酸和膽固醇取代SlSCP-2結(jié)合1,8-ANS的抑制常數(shù)IC50分別是18.12±0.83和50.13±0.80 μM，而蛋白與底物的分子對(duì)接分析也表明SlSCP-2對(duì)花生四烯酸和膽固醇有很高的親和力[27].本研究通過分析SlSCPx/SlSCP-2蛋白的結(jié)合底物脂肪酸(花生四烯酸)和膽固醇處理后SlSCPx和SlSCP-2 mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)均不能顯著誘導(dǎo)SlSCPx基因的表達(dá)[27].這也暗示SlSCPx基因的表達(dá)屬于基礎(chǔ)表達(dá)來保證機(jī)體對(duì)膽固醇的需求.

3.2 SlSCPx轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

為驗(yàn)證斜紋夜蛾SlSCPx基因的調(diào)控機(jī)制，克隆了該基因5'端上游3311 bp的啟動(dòng)子調(diào)控區(qū).對(duì)SlSCPx啟動(dòng)子序列的反應(yīng)元件預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)可能存在VVL、SLBO(C/EBP)、TLL、Elf-1、AbdB、AP-1、BRC-Z4等反應(yīng)元件，于是克隆這些轉(zhuǎn)錄因子的ORF,并構(gòu)建原核表達(dá)載體和真核超表達(dá)載體.在Spli-221細(xì)胞中表達(dá)C/EBP-EGFP，發(fā)現(xiàn)C/EBP和SlSCPx-P-1214與SlSCPx-P-1243之間的29個(gè)堿基序列結(jié)合后上調(diào)報(bào)告基因的表達(dá).為了進(jìn)一步驗(yàn)證C/EBP 蛋白與調(diào)控序列結(jié)合的特異性，運(yùn)用體外表達(dá)和純化的C/EBP 蛋白進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，C/EBP蛋白可能以二聚體的方式與反應(yīng)元件結(jié)合[26].

C/EBP家族蛋白C端含有典型的堿性亮氨酸拉鏈(βZIP)結(jié)構(gòu)，以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮作用，參與細(xì)胞增殖、分化、營(yíng)養(yǎng)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)答等生理過程的調(diào)節(jié)[28-33].果蠅的SLBO蛋白是昆蟲中最早發(fā)現(xiàn)的C/EBP蛋白，在卵子發(fā)生過程中的慢邊緣細(xì)胞遷移具有重要的調(diào)控作用[34]，它以二聚體的形式結(jié)合到順式作用元件上，調(diào)控靶基因表達(dá)[35].家蠶中已發(fā)現(xiàn)3種C/EBP同源蛋白，分別為BmC/EBP、BmCbZ 和BmC/EBPγ.C/EBP蛋白通過與不同絨毛膜基因啟動(dòng)子區(qū)C/EBP反應(yīng)元件結(jié)合力的強(qiáng)弱，調(diào)控絨毛膜發(fā)生過程中早、晚基因的時(shí)序表達(dá)[36].此外，C/EBP蛋白還可參與胚胎分化、發(fā)育過程的調(diào)控[35].研究表明，C/EBP蛋白在抵御微生物入侵方面發(fā)揮重要作用，家蠶抗菌肽基因如Cecropins,Lebocin,Moricin和NOsynthase(NOS)啟動(dòng)子區(qū)域均含有C/EBP作用位點(diǎn).本研究結(jié)果表明，昆蟲中C/EBP蛋白可能具有更廣泛的功能.在Spli-221細(xì)胞中，C/EBP蛋白對(duì)SlSCPx基因表達(dá)的促進(jìn)作用不需要外源物質(zhì)誘導(dǎo)，這表明C/EBP蛋白對(duì)基因的基礎(chǔ)表達(dá)是必需的.而脊椎動(dòng)物中SCPx基因的基礎(chǔ)表達(dá)和激素誘導(dǎo)表達(dá)必須有SF-1的參與[21].這可能說明不管對(duì)昆蟲還是脊椎動(dòng)物來講，保證體內(nèi)一定量的SCPx和(或)SCP-2蛋白水平是很重要的.C/EBP蛋白是否參與斜紋夜蛾體內(nèi)SlSCPx基因的時(shí)空表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控及其調(diào)控機(jī)理需要進(jìn)一步的研究.

4 結(jié)語

SCP-2作為膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以促進(jìn)甾類物質(zhì)的吸收和合成.在昆蟲體內(nèi)，吸收膽固醇用于蛻皮激素的合成.任何影響激素合成的因素都有可能影響幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育.對(duì)SlSCPx基因表達(dá)調(diào)控的研究，為害蟲的防治發(fā)展了新的作用靶標(biāo)(C/EBP).針對(duì)新的靶標(biāo)，可以篩選更多有效的抑制劑，以開發(fā)新型殺蟲劑用于害蟲防治.同時(shí)，本研究還為其他昆蟲營(yíng)養(yǎng)靶標(biāo)的研究提供借鑒與參考,為開發(fā)新農(nóng)藥提供了理論依據(jù).