中藥有效成分作用靶點(diǎn)研究的策略與實(shí)踐＊

趙玉男，謝偉東，邢東明，余 煊，杜力軍＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 南京 210046；2.清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康學(xué)部健康科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518055；3.清華大學(xué)生命科學(xué)院藥物藥理研究室 北京 100084）

中藥有效成分作用靶點(diǎn)研究的策略與實(shí)踐＊

趙玉男1，謝偉東2，邢東明3，余 煊3，杜力軍3＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 南京 210046；2.清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康學(xué)部健康科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518055；3.清華大學(xué)生命科學(xué)院藥物藥理研究室 北京 100084）

中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效和機(jī)制研究已較充分，然而靶點(diǎn)的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，這和靶點(diǎn)研究本身的被動(dòng)性和難度有一定關(guān)系。本文基于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，并結(jié)合筆者的研究實(shí)踐，對(duì)此進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探討。本文主要介紹三種技術(shù)路徑：“線索”驅(qū)動(dòng)、噬菌體展示以及親和垂釣。并提及兩種方案：酶解法和光交聯(lián)法?；谶@些技術(shù)方案，加強(qiáng)中藥有效成分靶點(diǎn)研究的實(shí)踐，將會(huì)有助于闡明中藥治療疾病的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)，有助于發(fā)展現(xiàn)代中藥和創(chuàng)新中藥。

中藥 有效成分 作用靶點(diǎn) 噬菌體展示 親和垂釣

應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法，結(jié)合物質(zhì)基礎(chǔ)研究，揭示中藥治療疾病的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)，是中藥藥理學(xué)的主要任務(wù)之一[1]。該任務(wù)的本質(zhì)是對(duì)傳統(tǒng)中藥臨床療效進(jìn)行證實(shí)或證偽的一個(gè)科學(xué)過(guò)程。因此，中藥藥理學(xué)也是一個(gè)“假說(shuō)后立”的研究，尋找證據(jù)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究而言，藥理學(xué)的證據(jù)包括物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)過(guò)程、藥效、作用機(jī)制以及靶點(diǎn)等。在物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)過(guò)程明確的情況下，“藥效-機(jī)制-靶點(diǎn)”可以看成是一條“證據(jù)鏈”，用于證實(shí)或證偽，在這條“證據(jù)鏈”中，靶點(diǎn)是重中之重。

目前，中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)（有效成分）及體內(nèi)過(guò)程已較清楚，有效成分的藥效和作用機(jī)制研究也比較充分，然而靶點(diǎn)的研究相對(duì)較少，體內(nèi)作用靶點(diǎn)明確的有效成分寥寥無(wú)幾。因此，對(duì)于中藥療效的證實(shí)或證偽而言，“證據(jù)鏈”是不完整的，缺少靶點(diǎn)這樣的有力證據(jù)。為此，中藥有效成分體內(nèi)作用靶點(diǎn)研究應(yīng)成為中藥藥理學(xué)今后的主要研究方向。然而，靶點(diǎn)的研究并非易事，對(duì)于少數(shù)幾個(gè)靶點(diǎn)清楚的有效成分，其體內(nèi)作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的過(guò)程有些“偶然性”。 最具代表性的是大麻素受體的發(fā)現(xiàn)，80年代末，Matsuda等人將從大鼠大腦皮質(zhì)cDNA文庫(kù)中分離到的一個(gè)cDNA（SKR6）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中后，體外與大麻類(lèi)物質(zhì)孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)有反應(yīng)而偶然發(fā)現(xiàn)的?！芭既恍浴逼鋵?shí)意味著靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的被動(dòng)性和困難性，這可能是當(dāng)前靶點(diǎn)研究成果相對(duì)匱乏的原因。為了提高靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的效率，必須要有一套可主動(dòng)發(fā)現(xiàn)有效成分體內(nèi)作用靶點(diǎn)的技術(shù)路徑。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外科研人員主要提出了3種解決方案，我們將其歸納為：“線索”驅(qū)動(dòng)（Action-Trial Leading）、噬菌體展示（Phage Display）和親和垂釣（Pull Down）[4]等，并展開(kāi)了相應(yīng)的科學(xué)實(shí)踐。本文將以此為主線，對(duì)于中藥小分子藥理作用靶點(diǎn)的策略進(jìn)行初步論述。

1 “線索”驅(qū)動(dòng)

“線索”驅(qū)動(dòng)是指有效成分經(jīng)體內(nèi)過(guò)程、藥效和作用機(jī)制研究后，研究人員根據(jù)研究得到的“線索”，推測(cè)出或假設(shè)和該有效成分可能有相互作用的蛋白質(zhì)或核酸，然后采用生物技術(shù)做靶點(diǎn)的驗(yàn)證性研究。例如關(guān)于小檗堿的研究就是基于該策略，通過(guò)研究首次揭示了小檗堿的2個(gè)核酸靶點(diǎn)：保持mRNA穩(wěn)定的Poly（A）和基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的TATA box[5]，其研究路徑如下所述：

1.1 小檗堿可進(jìn)入細(xì)胞核

將小檗堿和PC12細(xì)胞共孵育，采用激光共聚焦顯微鏡，觀察60 min內(nèi)的動(dòng)態(tài)發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間的推移，綠色熒光（小檗堿）在細(xì)胞核的位置開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸加強(qiáng)，暗示小檗堿可進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)小檗堿的高效液相色譜定量分析進(jìn)一步驗(yàn)證了上述的發(fā)現(xiàn)，時(shí)量曲線顯示：小檗堿可快速進(jìn)入細(xì)胞核，達(dá)峰時(shí)間約為12 h左右[6]。

1.2 小檗堿可與遺傳組分相互作用

進(jìn)入細(xì)胞核的小檗堿可與遺傳組分發(fā)生相互作用，早先的研究顯示：作為一種DNA的嵌入劑，小檗堿可與人工合成的DNA發(fā)生相互作用。課題組進(jìn)一步采用熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)，驗(yàn)證了小檗堿可與天然的遺傳組分相互作用，比如：染色質(zhì)、質(zhì)粒和基因組；并采用了等溫滴定量熱法測(cè)得小檗堿與染色質(zhì)、質(zhì)粒以及基因組的平衡解離常數(shù)（K）分別為：15 672、97 380和117 147[6]。

1.3 保持mRNA穩(wěn)定的Poly（A）

小檗堿雖可與遺傳組分相互作用，但具體作用位點(diǎn)不清楚。課題組在一項(xiàng)小檗堿抗腦缺血再灌注的藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)：小檗堿體外可拮抗氧糖剝奪誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，機(jī)制與其阻止模型細(xì)胞內(nèi)Retinoblastoma（Rb）蛋白表達(dá)的下降有關(guān)；此外，對(duì)于Rb蛋白敲除的PC12細(xì)胞系，小檗堿喪失了其抗細(xì)胞凋亡的作用；這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Rb蛋白是小檗堿抗氧糖剝奪藥效的作用環(huán)節(jié)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿拮抗模型細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)下降的機(jī)制和Rb的mRNA有關(guān)。然而，小檗堿并不能增強(qiáng)Rb的轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明小檗堿不能增加Rb的mRNA表達(dá)水平。因此，課題組推測(cè)小檗堿抗模型細(xì)胞內(nèi)Rb mRNA下降的機(jī)制可能與其能保持Rb mRNA的穩(wěn)定有關(guān)。上述推測(cè)得到了體外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)：在采用放線菌素D抑制基因轉(zhuǎn)錄的模式細(xì)胞中，氧糖剝奪可明顯增加Rb mRNA降解的速度；小檗堿不但能減弱模式細(xì)胞在正常培養(yǎng)狀態(tài)下Rb mRNA降解的速度，還能拮抗氧糖剝奪導(dǎo)致的Rb mRNA降解速度的增加。

眾所周知，mRNA的Poly（A）尾巴與其穩(wěn)定性密切相關(guān)，那么小檗堿穩(wěn)定Rb mRNA的機(jī)制是否與Poly（A）有關(guān)。課題組分別構(gòu)建了帶Poly（A）和不帶Poly（ A）的Rb表達(dá)質(zhì)粒，帶Pol（A）的Rb表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，其胞內(nèi)Rb mRNA的水平遠(yuǎn)高于不帶Poly（ A）的Rb表達(dá)質(zhì)粒。而且，小檗堿只對(duì)帶Poly（A）的Rb mRNA有作用；對(duì)不帶Poly（A）的Rb mRNA，無(wú)論是在正常培養(yǎng)狀態(tài)下還是氧糖剝奪狀態(tài)下，小檗堿均不能發(fā)揮其抑制mRNA降解的作用。

從抗凋亡、Rb蛋白、Rb mRNA、mRNA的穩(wěn)定到Poly（A），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)Poly（A）是小檗堿的核酸作用靶點(diǎn)。最后，課題組采用熒光光譜（FRET）及其二維核磁共振譜（2D-NMR）技術(shù)確證小檗堿和Poly（A）之間存在直接的物理相互作用，Poly（A）是小檗堿的核酸作用靶點(diǎn)[5,7]。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的TATA box

課題組在另一項(xiàng)小檗堿抗熱應(yīng)激的藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)：小檗堿可拮抗熱應(yīng)激引起的小鼠體溫升高，抑制模型動(dòng)物過(guò)多分泌熱休克蛋白70（HSP70）；而且，HSP70的蛋白水平與其mRNA水平呈正相關(guān)性，提示小檗堿抑制HSP70的蛋白表達(dá)與HSP70的mRNA密切相關(guān)[8]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可通過(guò)直接抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄活性，降低HSP70的mRNA表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致HSP70蛋白水平的下降。值得注意是，小檗堿對(duì)Rb的轉(zhuǎn)錄活性并沒(méi)有影響。這兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果提示，小檗堿抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄活性可能與轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中的酶活性無(wú)關(guān)，而與基因啟動(dòng)子區(qū)的堿基序列有關(guān)，否則不會(huì)出現(xiàn)這種選擇性轉(zhuǎn)錄活性降低的現(xiàn)象。分析HSP70和Rb基因啟動(dòng)子區(qū)的堿基序列發(fā)現(xiàn)，HSP70基因啟動(dòng)子區(qū)含TATA box，而Rb基因啟動(dòng)子區(qū)含GC box，不含TATA box，那么小檗堿抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄活性是否與TATA box有關(guān)。課題組分別構(gòu)建了啟動(dòng)子區(qū)含TATA box和GC box的HSP70表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后小檗堿只對(duì)啟動(dòng)子區(qū)含TATA box的HSP70質(zhì)粒表達(dá)有抑制作用，而對(duì)啟動(dòng)子區(qū)含GC box的HSP70質(zhì)粒表達(dá)無(wú)明顯影響，表明小檗堿抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄活性與TATA box相關(guān)[5]。

至此，從抗熱應(yīng)激、HSP70蛋白、HSP70 mRNA、mRNA的轉(zhuǎn)錄到TATA box，課題組同樣在眾多“線索”的指引下，高度懷疑TATA box是小檗堿的核酸作用靶點(diǎn)。與Poly（A）一樣，課題組最后采用FRET技術(shù)確證小檗堿和TATA box之間存在直接的物理相互作用，TATA box是小檗堿另外一個(gè)核酸作用靶點(diǎn)；并基于電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）和免疫共沉淀技術(shù)（ChIP），發(fā)現(xiàn)小檗堿和TATA box結(jié)合后，可干預(yù)TATA box和TATA結(jié)合蛋白（TBP）之間的結(jié)合，進(jìn)而干擾基因轉(zhuǎn)錄[6]。

2 噬菌體展示

噬菌體展示技術(shù)最早建立于1985年，其原理是以噬菌體為載體，將外源基因片段克隆至噬菌體外殼蛋白基因中，并以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體外殼。噬菌體本身的粘附、侵入及整合功能并不會(huì)因外源性DNA片段的插入而受到影響，同時(shí)外源片段在噬菌體外殼的表達(dá)也保持了其原有的三維空間構(gòu)像。大量的這樣表達(dá)有外源片段的噬菌體就組成了噬菌體展示文庫(kù)。噬菌體展示文庫(kù)提供了大量的蛋白質(zhì)/多肽結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)了高通量和高效率篩選的可能性，已廣泛運(yùn)用于抗原表位分析、分子相互作用、單克隆抗體的制備、疫苗研制及藥物篩選等多個(gè)研究領(lǐng)域[9]。近些年來(lái)，陸續(xù)有研究人員提出將噬菌體展示技術(shù)運(yùn)用到小分子藥物體內(nèi)靶點(diǎn)蛋白的發(fā)現(xiàn)上[10-12]。

2.1 生物淘洗

噬菌體展示技術(shù)的篩選原理又稱(chēng)“生物淘洗”，該技術(shù)是利用分子間的特異性親和力進(jìn)行的。首先，將待研究的目標(biāo)分子（小分子或大分子）通過(guò)共價(jià)鍵固定在載體上，加入噬菌體文庫(kù)，令其充分相互作用進(jìn)行結(jié)合選擇；在此過(guò)程中，可與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的噬菌體克隆將結(jié)合到載體上，未結(jié)合的噬菌體克隆被直接洗去。然后，用緩沖液將結(jié)合的噬菌體克隆洗脫下來(lái)，收集洗脫的噬菌體克隆感染宿主進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的噬菌體再次重復(fù)上述的結(jié)合篩選。如此經(jīng)過(guò)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”循環(huán)式的3-5輪篩選，最終洗脫得到的噬菌體克隆經(jīng)初步結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定后，分別挑取單個(gè)克隆進(jìn)行基因序列分析，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析得到其對(duì)應(yīng)的基本氨基酸序列，即為可與目標(biāo)分子有特異性結(jié)合的氨基酸序列。最后，在生物信息學(xué)的幫助下，分析生物體內(nèi)含有上述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)即有可能是目標(biāo)分子在生物體內(nèi)的靶蛋白。

1999年，Rodi等[13]較早利用上述噬菌體展示技術(shù)，對(duì)抗癌藥物紫杉醇進(jìn)行生物淘選，最終鑒定Bcl-2可能是紫杉醇在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)。Yu等[14]將地塞米松固定在Eppendorf管壁上，4輪淘洗后鑒定得到了與其結(jié)合的氨基酸序列，經(jīng)GenBank檢索發(fā)現(xiàn)具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)為細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ和白蛋白，從而發(fā)現(xiàn)了糖皮質(zhì)激素體內(nèi)其它可能存在的作用位點(diǎn)。Van Dorst等[15]采用T7 cDNA噬菌體展示文庫(kù)淘選，經(jīng)BLAST同源檢索后，既得到了雙酚A已知的作用靶點(diǎn)α-微管蛋白，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了雙酚A未知新的疑似作用靶蛋白-轉(zhuǎn)錄相關(guān)酸性卷曲蛋白3（Transforming Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3，TACC3）。2011年，Van Dorst等[16]采用了相同的技術(shù)研究了17β雌二醇體內(nèi)的蛋白靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的未知靶點(diǎn)：beclin 1和ATP合成酶F0亞單位6。類(lèi)似的研究還包括對(duì)全氟辛烷磺酸[17]、環(huán)孢霉素A[18]、甲氨蝶呤[19]、伊立替康[20]和撲熱息痛[21]等單體小分子藥物，以及三水白虎湯[22]等多組分有效成分的研究上。

作為最早用來(lái)主動(dòng)發(fā)現(xiàn)小分子體內(nèi)作用靶點(diǎn)的方案，噬菌體展示中的生物淘洗法已有多個(gè)成功的實(shí)例報(bào)道。然而，從對(duì)糖皮質(zhì)激素和雌激素的研究結(jié)果來(lái)看，該方案并未發(fā)現(xiàn)大家所熟知的糖皮質(zhì)激素受體或雌激素受體，因此有一定的局限性，這可能和噬菌體展示文庫(kù)的容量大小有關(guān)。噬菌體展示方案在2010年左右迎來(lái)一個(gè)研究高峰；不過(guò)自2013年起至今，在Pubmed上檢索“phage display”已鮮有最新研究報(bào)道。此外，通過(guò)噬菌體展示方案得到的疑似靶蛋白，更多都停留在疑似階段，很少有進(jìn)一步的小分子與靶點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)和功能確證性研究。此為其局限之處。

2.2 功能基團(tuán)熒光展示

上述生物淘洗法通過(guò)小分子化合物上的功能基團(tuán)與固相載體偶聯(lián)，也會(huì)導(dǎo)致功能基團(tuán)周邊的空間結(jié)構(gòu)受到阻礙，因此就不會(huì)“垂釣”出與該空間結(jié)構(gòu)有親和力的噬菌體克隆，功能基團(tuán)熒光展示法可使小分子化合物在自由狀態(tài)下與噬菌體文庫(kù)進(jìn)行結(jié)合，理論上可彌補(bǔ)該不足。盡管該方法目前還未出現(xiàn)成功的案例報(bào)道，但它已經(jīng)開(kāi)始在一些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)踐，原理如下：

首先，如果小分子化合物與噬菌體克隆發(fā)生特異性結(jié)合，那么該小分子化合物有可能會(huì)屏蔽掉多肽上結(jié)合處的某些功能基團(tuán)，比如氨基、羧基或者酚羥基等。然后，用化學(xué)反應(yīng)的方法將那些沒(méi)有被屏蔽的功能基團(tuán)保護(hù)起來(lái)。接著，將小分子化合物從結(jié)合的噬菌體克隆上洗脫下來(lái)，暴露出那些活性功能基團(tuán)，再用化學(xué)反應(yīng)的方法將這些功能基團(tuán)連接上熒光物質(zhì)。最后，將這些有熒光的噬菌體克隆挑選出來(lái)感染宿主進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的噬菌體再次重復(fù)上述的流程。如此經(jīng)過(guò)3-5輪循環(huán)式篩選，最終可得到與小分子化合物特異性結(jié)合的噬菌體克隆，剩下的步驟同上述生物淘洗法。

圖1 R1位點(diǎn)含糖基的人參皂苷單體和含氨基的樹(shù)脂偶聯(lián)后示意圖

3 親和垂釣

在生物分子中，有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱(chēng)為親和力。親和垂釣就是根據(jù)這個(gè)原理，將目標(biāo)分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過(guò)層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒(méi)有親和力的蛋白質(zhì)直接流出，從而與目標(biāo)蛋白質(zhì)分開(kāi)，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

中藥有效成分為小分子化合物，可作為“配體”或者“底物”直接連接（連接原理可參照小分子半抗原/人工抗原的制備[23]）或通過(guò)引入標(biāo)簽間接連接到固相載體上（比如：小分子引入生物素標(biāo)簽，再和有親和素的固相載體連接），然后通過(guò)親和層析的方法“垂釣”出與其有親和作用的蛋白質(zhì)群（在“垂釣”出靶蛋白的同時(shí)也會(huì)帶出與靶蛋白有親和力的其它蛋白質(zhì)），再通過(guò)1維（1D）或者2維（2D）蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行分離，挖取單個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。最后，根據(jù)鑒定的結(jié)果，采用分子間相互作用研究技術(shù)對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)和目標(biāo)小分子進(jìn)一步做親和力分析，從而發(fā)現(xiàn)可與目標(biāo)小分子直接發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。自蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定商業(yè)化運(yùn)作后，斷續(xù)出現(xiàn)采用該技術(shù)探索小分子體內(nèi)蛋白質(zhì)作用靶點(diǎn)的報(bào)道。2007年，Wulff等[24]采用生物素標(biāo)簽將（+）-avrainvillamide連接到固相載體上“垂釣”細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)，基于蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、Werstern Blot、競(jìng)爭(zhēng)性親和抑制以及基因突變等技術(shù)，鑒定出（+）-avrainvillamide細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)作用靶點(diǎn)為核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）。2015年，Wang等[25]同樣采用生物素標(biāo)簽將青蒿素連接到固相載體上，從瘧原蟲(chóng)中“垂釣”出多達(dá)124個(gè)疑似蛋白質(zhì)作用靶點(diǎn)，并經(jīng)熒光標(biāo)簽技術(shù)確認(rèn)血紅素可能是青蒿素對(duì)寄生蟲(chóng)產(chǎn)生殺傷作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本課題組采用小分子化合物和載體直接連接的方法，探索了人參皂苷抗疲勞藥效的體內(nèi)蛋白質(zhì)作用靶點(diǎn)[26,27]。分子間偶聯(lián)通常會(huì)導(dǎo)致小分子偶聯(lián)處的空間結(jié)構(gòu)受到阻礙，因此難以“垂釣”出與該空間結(jié)構(gòu)有親和力的蛋白質(zhì)。由圖1可知，如果通過(guò)R1位點(diǎn)的糖基采用高碘酸氧化的方法和固相載體偶聯(lián)，那么R1位點(diǎn)周邊的空間結(jié)構(gòu)將會(huì)被屏蔽。同理，如果通過(guò)R3位點(diǎn)的糖基和固相載體偶聯(lián)，那么R3位點(diǎn)周邊的空間結(jié)構(gòu)將會(huì)被屏蔽，但是R1位點(diǎn)周邊的空間結(jié)構(gòu)會(huì)充分暴露。故我們推測(cè)，可以采用混合皂苷作為“配體”或者“底物”有效解決空間結(jié)構(gòu)屏蔽，以實(shí)現(xiàn)人參皂苷的空間結(jié)構(gòu)充分暴露。為此，我們采用高純度的人參總皂苷作為偶聯(lián)對(duì)象，通過(guò)親和樹(shù)脂的制備、骨骼肌勻漿液親和“垂釣”、蛋白質(zhì)電泳分析以及蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)8個(gè)疑似蛋白（表1）。

表1 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定各凝膠條帶所得疑似蛋白質(zhì)

由于在人參總皂苷親和“垂釣”腦組織勻漿實(shí)驗(yàn)中也鑒定出了肌酸激酶，本課題組選定肌酸激酶，采用生物膜干涉技術(shù)優(yōu)先對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)。采用ForteBio的分子間相互作用儀Octet RED96研究了人參皂苷單體、苷元與肌酸激酶（MM型和MB型）的相互作用，獲得其結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)和親和力等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示：僅原人參二醇和肌酸激酶有一定的分子間相互作用，進(jìn)一步結(jié)合解離動(dòng)力學(xué)研究得出：原人參二醇與肌酸激酶（MM型）的親和力（KD）值為2.53×10-5,與肌酸激酶（MB型）的親和力（KD）值為9.23×10-6。上述結(jié)果提示我們，盡管肌酸激酶是人參總皂苷偶聯(lián)樹(shù)脂親和“垂釣”而得，但實(shí)際上和肌酸激酶有較強(qiáng)相互作用的是原人參二醇。

原人參二醇與肌酸激酶相互作用之后，會(huì)對(duì)肌酸激酶產(chǎn)生何種效應(yīng)，我們初步分析了原人參二醇體外對(duì)肌酸激酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)原人參二醇與肌酸激酶相互作用后可增加該酶的活性，可能是肌酸激酶的激活劑。由于肌酸激酶是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮以及ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，因此肌酸激酶活性的增加將有助于機(jī)體抗物理疲勞，再加上人參總皂苷中的二醇型皂苷可在體內(nèi)代謝成原人參二醇，從而可合理解釋人參總皂苷為什么可以抗疲勞。不過(guò)，該解釋需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，目前該部分的研究正在進(jìn)行中。

總之，親和“垂釣”方案與蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)的成熟密不可分，雖已有一些成功的案例報(bào)道，但整體也還處于技術(shù)路線優(yōu)化探索的階段。

4 小結(jié)

綜上所述，除了偶然發(fā)現(xiàn)之外，我們也可以依靠“線索”或者篩選的方法來(lái)主動(dòng)探索中藥有效成分體內(nèi)的作用靶點(diǎn)?！熬€索”驅(qū)動(dòng)方案相對(duì)耗時(shí)、耗力，并需要確保每個(gè)“線索”的真實(shí)性和可靠性，在邏輯思維的指引下向作用靶點(diǎn)逐漸靠近。從原理上來(lái)看，噬菌體展示和親和垂釣是帶有篩選性質(zhì)的兩套完全不同的技術(shù)方案；從發(fā)現(xiàn)高度疑似靶蛋白的角度上來(lái)看，這兩個(gè)方案相對(duì)快速和高效。

除此，目前還有幾種處于探索階段的技術(shù)方案，比如：酶解法[28,29]和光交聯(lián)法[30]。所有這些技術(shù)方案最初應(yīng)用的出發(fā)點(diǎn)可能并不是為了小分子作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，但經(jīng)適當(dāng)調(diào)整后用于中藥有效成分作用靶點(diǎn)的探索均是可行的。因此，基于這些技術(shù)方案，加強(qiáng)實(shí)踐，一定能揭示中藥有效成分體內(nèi)的作用靶點(diǎn)，如此將有助于闡明中藥作用機(jī)制，及其相關(guān)藥物的研究與開(kāi)發(fā)。

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Advances in Research Approachs of Action Targets of Active Ingredients from Chinese Herbs

Zhao Yunan1, Xie Weidong2, Xing Dongming3, Yu Xuan3, Du Lijun3
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. Key Laboratory of Health Science and Technology, Division of Life Science & Health, Graduate School at

Nowadays, there has been many researches on the material basis, effectiveness and action mechanisms of Chinese herbs. However, the action target research of active ingredients from herbs is relatively less, which may be associated with its own passivity and difficulty of current target research. For improving the target discovery efficiency of active components, it is critical to approach some initiatives by technical routes to find targets. In this review, based on the domestic and foreign literatures and our previous researches, three different technical routes for the target discovery of active ingredients were introduced in detail, including “clue” drive, phage display and pull-down, and other two options--drug affinity responsive target stability (DARTS) and light cross-linking. Using these technical approaches, it is benefitial to clarifing the modern science basis of Chinese herbs by strengthening the target research practice of active components, and developing modern and innovative Chinese herbs.

Chinese herbs, active ingredients, action target, phage display, pull down

10.11842/wst.2016.06.012

R96

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應(yīng)激致海馬結(jié)構(gòu)可塑性損傷中的作用研究，負(fù)責(zé)人：趙玉男；國(guó)家自然科學(xué)基金委重大研究計(jì)劃（90713043）：基于小檗堿神經(jīng)元保護(hù)作用探討其PI3-K/AKT作用的始動(dòng)位點(diǎn)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)責(zé)人：杜力軍。＊＊ 通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，主要研究方向：藥理學(xué)。