缺氧誘導因子1-α基因C1744T多態(tài)與先天性心臟病的相關(guān)性研究

倪世宏　劉興元　魏　東　楊奕清

200431 上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院寶山分院兒科(倪世宏)；200065 上海，同濟大學醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科(劉興元)；200040 上海，上海交通大學附屬兒童醫(yī)院兒科(魏　東)；200030 上海，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院心血管研究室(楊奕清)

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缺氧誘導因子1-α基因C1744T多態(tài)與先天性心臟病的相關(guān)性研究

倪世宏劉興元魏東楊奕清

先天性心臟病 (congenital heart disease, CHD) 是人類最常見的發(fā)育異常，可導致運動耐力降低、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、血栓栓塞、肺動脈高壓、心力衰竭、心律失常和心源性猝死，而且是嬰幼兒最常見非感染性死因[1-2]。越來越多的證據(jù)顯示，遺傳缺陷是CHD發(fā)生的重要原因，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多基因變異與CHD有關(guān)[3-6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導因子1-α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α) 基因?qū)π呐K的正常發(fā)育、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能具有重要作用。在小鼠，HIF1α基因敲除可導致胚胎期死亡，主要是由各種心血管發(fā)育缺陷所致，包括原始心管融合、環(huán)化障礙以及心肌特化、分化異常和心室畸形等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIF1α基因多態(tài)與人類多種疾病有關(guān)，包括缺血性心臟病、腫瘤、糖尿病等[9-12]。由于位于HIF1α基因第12個外顯子的C1744T多態(tài)(也被稱為c.1744C>T、p.P582S、C1772T或rs11549465多態(tài))已被證實對HIF1α的功能具有顯著地增強作用[12]，因此，本研究首先明確HIF1α基因C1744T多態(tài)與CHD的相關(guān)性。

1對象與方法

1.1研究對象

隨機選取110例無血緣關(guān)系的中國漢族CHD患兒為病例組,其中男62例，女48例,年齡0～5歲，平均2歲;200名無血緣關(guān)系的中國漢族無CHD兒童為對照組,男115例，女85例,年齡0～5歲，平均2歲。詳細詢問病史、全面體檢以及心臟彩色多普勒超聲檢查。全部CHD患兒均經(jīng)心臟超聲或心臟手術(shù)確診，排除綜合征型CHD患者。經(jīng)兒童父母知情同意后收集其血常規(guī)檢驗后原本丟棄的剩余血，使用基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)，按照操作說明提取全部研究對象的基因組DNA。

1.2方法

1．2．1擴增HIF1α基因第12外顯子的引物設(shè)計

登錄美國的生物信息中心網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進入核苷酸數(shù)據(jù)庫(登錄號NG_029606)下載HIF1α基因的基因組DNA序列，使用在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計一對擴增HIF1α基因第12外顯子的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。其中正向引物序列是5’-GAAGTGACTTTGAGTTTCACTTGT-3’，反向引物序列是5’-CTCAAGAATTTGCGTTAGGGCAT-3’，所擴增片段的大小為639 bp。

1．2．2HIF1α基因第12外顯子的擴增

以基因組DNA為模板，使用上述引物和HotStar Taq DNA聚合酶(德國Qiagen公司)等聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑，在PE9700型熱循環(huán)儀(美國Applied Biosystem公司)上擴增HIF1α基因第12外顯子。PCR反應(yīng)的總體積為25 μL,包括10×緩沖液2．5 μL，5×Q溶液5 μL，dNTP(各2．5 mmol/L)2 μL，基因組DNA(200 ng/μL)1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, HotStar Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0．25 μL和雙蒸水13．25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性15 min，此后進入35個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后使用凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)純化所擴增的DNA片段。

1．2．3HIF1α基因第12外顯子多態(tài)掃描

使用上述正向引物、純化的DNA片段和DNA測序試劑盒(美國Applied Biosystem公司)在PE9700型熱循環(huán)儀(美國Applied Biosystem公司)上進行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)的總體積為10 μL,包括預混合液4 μL，純化的DNA(20ng/μL)2 μL，上游引物(2 μmol/L)1 μL和雙蒸水3 μL。測序反應(yīng)的條件是：總計30個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃變性20 s，50 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后在3130 XL 型DNA測序儀(美國Applied Biosystem公司)上進行測序。使用 DNA序列分析軟件(美國Applied Biosystem公司)分析測序結(jié)果并將所測序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫中的已知HIF1α基因序列(登錄號NG_029606)進行對比以識別HIF1α基因多態(tài)。

1．3統(tǒng)計學分析

使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標準差表示。兩組連續(xù)變量的比較使用非配對Student’st檢驗，兩組分類變量的比較根據(jù)需要使用Pearson’sχ2檢驗或Fisher 精確概率計算。雙側(cè)統(tǒng)計值P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2．1CHD患兒的臨床特點

對照組與病例組兒童的年齡和性別匹配，均無明確的CHD相關(guān)環(huán)境危險因素，如母親在懷孕頭3個月患病或服用藥物、父母吸煙以及長期接觸毒物或射線等。110例CHD患兒的基本臨床特點見表1。

表1　110例CHD患兒的基本臨床特點

注：CHD，先天性心臟?。籚SD，室間隔缺損；ASD，房間隔缺損；PDA，動脈導管未閉；TOF，法洛四聯(lián)癥。

2．2HIF1α基因C1772T多態(tài)的發(fā)現(xiàn)

通過對研究對象進行PCR測序發(fā)現(xiàn)，在CHD患兒和健康兒童均存在HIF1α基因C1744T多態(tài)。顯示HIF1α基因編碼外顯子序列第1744位的純合等位基因C、純合等位基因T以及雜合等位基因C/T的代表性測序結(jié)果見圖1。

2．3HIF1α基因C1744T多態(tài)在2組中的頻率差異

在HIF1α基因編碼核苷酸序列第1744位的等位基因C、T及其構(gòu)成的3種基因型CC、CT、TT在CHD在病例組和對照組間的頻率分布存在顯著性差異，病例組等位基因T及基因型CT和TT的頻率較低(見表2)。兩組等位基因頻率經(jīng)Fisher精確檢驗比較，P=0.0179；兩組基因型頻率經(jīng)Fisher精確檢驗比較，P=0.0139。

表2　CHD患兒和無CHD對照者的

注：兩組基因型頻率比較，P=0.0179；等位基因頻率比較，P=0.0139

注：箭頭所指為純合等位基因C、純合等位基因T以及雜合等位基因C/T圖1　HIF1α基因c.1744C>T多態(tài)序列圖

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α基因C1744T多態(tài)在病例組和對照組中的頻率分布存在顯著性差異，等位基因T及其構(gòu)成的基因型CT和TT在病例組組顯著低于對照組，提示等位基因T具有降低人類CHD易感性的保護性作用，HIF1α基因C1744T多態(tài)可能是人類進化選擇的有益結(jié)果。

人類HIF1α基因定位于14q21-24，有15個外顯子，編碼一種由826個氨基酸所組成的HIF1的α亞單位，與β亞單位一起以異二聚體的形式構(gòu)成功能性HIF1。HIF1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其中α亞單位既是調(diào)節(jié)亞單位又是活性亞單位，其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性均受細胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)；而β亞單位為多種轉(zhuǎn)錄因子所共有，可在細胞核中持續(xù)表達，且不受氧濃度影響，其功能可能與維持HIF1α二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及活性構(gòu)象有關(guān)[13]。HIF1α是目前所識別的唯一一個高度特異性的、在低氧條件下能夠發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，對氧濃度十分敏感，是專一調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的重要蛋白，也被稱為“缺氧基因表達的總開關(guān)”[13]。HIF1α作為轉(zhuǎn)錄因子與低氧反應(yīng)元件結(jié)合，可以誘導100多個重要下游靶基因的表達，包括血管內(nèi)皮生長因子基因、促紅細胞生成素基因、血紅素加氧酶l基因等，并通過調(diào)控這些靶基因而在心血管胚胎發(fā)育、紅細胞生成、細胞生長等方面發(fā)揮重要的生理作用[9,13-14]。因此，HIF1α基因?qū)π难艿恼０l(fā)育尤其是在低氧等惡劣環(huán)境下的正常發(fā)育具有不可替代的關(guān)鍵調(diào)控作用。

在人類，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種疾病相關(guān)HIF1α基因多態(tài)，其中研究得最多的是rs11549465(即c.1744C>T、p.P582S或C1772T多態(tài))和rs11549467(即c.1762G>A、p.A588T或G1790A多態(tài))多態(tài)，這兩種多態(tài)均顯著增強HIF1α對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，而且rs11549465多態(tài)的功能增強性作用更強[15-17]。既往的研究表明，HIF1α基因的這些功能多態(tài)與腫瘤、糖尿病、缺血性心臟病和腰椎間盤退行性變等多種疾病有關(guān)[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α基因c.1744C>T多態(tài)與CHD有關(guān)，等位基因T降低CHD的易感性，提示HIF1α的功能增強對心血管的正常發(fā)育具有重要的保護作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)人類HIF1α基因c.1744C>T多態(tài)與CHD的易感性降低有關(guān)，這為制定CHD防治策略提供了新的分子靶標。

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(收稿：2015-07-25修回：2015-09-28)

(本文編輯：丁媛媛)

200431 上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院寶山分院兒科(倪世宏)；200065 上海，同濟大學醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科(劉興元)；200040 上海，上海交通大學附屬兒童醫(yī)院兒科(魏東)；200030 上海，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院心血管研究室(楊奕清)

【摘要】目的：研究缺氧誘導因子1-α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α)基因C1744T多態(tài)與先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)的關(guān)系。方法：入選CHD患兒110例(病例組)及無CHD兒童200名(對照組)，收集其臨床資料和血標本，使用基因組DNA純化試劑盒抽提基因組DNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增HIF1α基因的第12個外顯子，應(yīng)用DNA測序試劑盒在DNA測序儀上對擴增片段進行測序。統(tǒng)計分析HIF1α基因C1744T多態(tài)在病例組和對照組間的頻率分布。結(jié)果：HIF1α基因編碼核苷酸序列第1744位的等位基因C、T及其構(gòu)成的3種基因型CC、CT、TT在CHD在病例組和對照組間的頻率分布存在顯著性差異，病例組等位基因T及基因型CT和TT的頻率較低(等位基因頻率經(jīng)Fisher精確檢驗比較,P=0.0179；基因型頻率經(jīng)Fisher精確檢驗比較,P=0.0139)。結(jié)論：HIF1α基因C1744T多態(tài)與CHD的易感性有關(guān)，等位基因T降低CHD的發(fā)生率。

【關(guān)鍵詞】先天性心臟病；遺傳學；基因多態(tài)性；缺氧誘導因子

Study on the association of the polymorphism of C1744T in the hypoxia-inducible factor 1-alpha gene with congenital heart diseaseNIShihong1,LIUXingyuan2,WEIDong3,YANGYiqing4. 1.DepartmentofPediatrics,BaoshanBranchofHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200431,China; 2.DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200065,China; 3.DepartmentofPediatrics,Children’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200040,China; 4.DepartmentofCardiovascularResearchLaboratory,ChestHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200030,China

【Abstract】Objective： To study the association of the polymorphism C1744T in the hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1α) gene with congenital heart disease (CHD).Methods： A total of 110 children with CHD (case group) and 200 children without CHD (control group) were recruited. The clinical data and blood samples from all the study participants were collected. The genomic DNA was extracted with DNA purification kit. The twelfth coding exon of the HIF1α gene was amplified by polymerase chain reaction. The amplicons were sequenced with DNA sequencing kit under a DNA Analyzer. The frequencydistributions of the polymorphism C1744T in HIF1αwere statistically analyzed between the case and control groups. Results： Between the case and control groups, there was significant difference in the frequency distributions of the alleles C and T at coding nucleotide 1 744 of HIF1α, as well as the genotypes of CC, CT and TT, with lower frequencies of allele T and genotypes CT and TT observed in the case group (for the comparison of allelic frequency by Fisher’s exact test,P=0.0179; for the comparison of genotypic frequency by Fisher’s exact test,P=0.0139).Conclusion： The polymorphism of C1744T in HIF1αis associated with the susceptibility to CHD, with allele T contributing to a decreased prevalence of CHD.

【Key words】Congenital heart disease; Genetics; Gene polymorphism; Hypoxia-inducible factor

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.01.014

·基礎(chǔ)研究·

基金項目：上海市寶山區(qū)自然科學基金(12-E-25)

通信作者：倪世宏，Email: ni_shihong@sina.com