高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠γ-氨基丁酸A受體mRNA表達(dá)的影響

陳曉陽　秦莉花　葉麗芝　黃　寬　李　晟

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,湖南　長沙　410208)

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高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠γ-氨基丁酸A受體mRNA表達(dá)的影響

陳曉陽1，2,3秦莉花葉麗芝1，2黃寬1，2李晟1，2,3

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,湖南長沙410208)

〔摘要〕目的探討高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠γ-氨基丁酸A受體(GABAAR)mRNA表達(dá)的影響。方法將大鼠隨機分為空白組、模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。其中4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組經(jīng)高鹽飲食干預(yù)1個月后，檢測行為學(xué)及海馬GABAAR mRNA表達(dá)情況。結(jié)果與模型組的開放臂進(jìn)入次數(shù)(OE)+封閉臂進(jìn)入次數(shù)(CE)、OE%、開放臂時間(OT)%比較，4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組GABAAR mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組GABAAR mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論高鹽飲食可能通過影響神經(jīng)遞質(zhì)GABA受體的表達(dá)加重更年期焦慮癥。

〔關(guān)鍵詞〕高鹽飲食；更年期焦慮癥；γ-氨基丁酸A受體mRNA

1中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室

2國家中醫(yī)藥管理局藥性與藥效研究三級實驗室

3湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

第一作者：陳曉陽(1953-)，女，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥性理論基礎(chǔ)與應(yīng)用的研究。

更年期焦慮癥已影響患者的健康、社會關(guān)系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產(chǎn)生自殺行為。更年期焦慮癥發(fā)生的病因病機尚未完全明確。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現(xiàn)為對食物口味改變，尤其要求食物中咸味重，而食鹽量的超標(biāo)會導(dǎo)致一系列的疾病，目前主要集中在高血壓、骨質(zhì)疏松等方面。前期實驗已證明高鹽飲食加重更年期焦慮癥，與細(xì)胞內(nèi)外的Na+、Cl-水平改變有關(guān)〔1〕。本課題運用分子生物學(xué)技術(shù)研究高鹽對更年期焦慮癥GABAAR mRNA表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選用11月齡的昆明雌性小鼠，清潔級，體重35～45 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部代購，動物合格證號：scxk(湘)2009-0012。將小鼠置于動物實驗室，室溫控制在(20±2)℃之間，濕度50%～70%。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠 5只。在同一條件下，用顆粒型普通飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 。

1.2試劑瓊脂糖(西班牙)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，EDTA 、Tris、DEPC、E.B.(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，Taq酶(Genstar)，引物(上海生工)，DL2000 DNA Marker、dNTP(Genstar)，SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)。其他常規(guī)化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3主要儀器①行為學(xué)檢測儀器：高架十字迷宮模型(EPM)，參照文獻(xiàn)〔2〕自制，由兩個相對的開放臂(35 cm×5 cm)、兩個相對的封閉臂(35 cm×5 cm×5 cm)、一個連接四只臂的中央平臺(5 cm×5 cm)組成。迷宮離地面50 cm，迷宮為木質(zhì)結(jié)構(gòu)，漆成黑色，2個開放臂同封閉臂呈相反方向，即開放臂-中央

平臺-開放臂或封閉臂-中央平臺-封閉臂，此二者互相垂直成為“+”形狀。由木板制成。②其他主要儀器：熒光定量RCP儀、熒光PCR板(Thermo)，恒溫水浴箱(J-MAX)，旋渦混合器(其林貝爾)，電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽(北京六一)，-80℃冰箱(中科美菱)。

1.4實驗方法

1.4.1分組取11月齡左右雌性小鼠，按文獻(xiàn)〔3〕方法連續(xù)5 d進(jìn)行陰道涂片檢查，呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的小鼠為自然更年期小鼠。按隨機原則，將40只11月齡更年期小鼠隨機分為4組，即空白組、模型組、 4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續(xù)給予普通飼料，4%高鹽飲食組小鼠予含4%氯化鈉(NaCl)高鹽顆粒飼料，8%高鹽飲食組小鼠予含8%的NaCl高鹽顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲用自來水，連續(xù)1個月。

1.4.2觀察指標(biāo)及方法

1.4.2.1高架十字迷宮實驗小鼠EPM實驗：迷宮測試前將每只小鼠放入一個50 cm×50 cm×30 cm塑料盒中，任其自由探究5 min 后迅速置于高架十字迷宮(EPM)的中央平臺處，使其頭部正對其中 一個開放臂，釋放后即開始記錄下述指標(biāo)：開放臂進(jìn)入次數(shù)(OE)：進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以小鼠4個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途1個爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動完成；開放臂時間(OT)：進(jìn)入開放臂的時間(s)；封閉臂進(jìn)入次數(shù)(CE)：進(jìn)入到任一封閉臂的次數(shù)，以小鼠4個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)；封閉臂時間(CT)：進(jìn)入封閉臂的時間(s)；實驗結(jié)束后分別計算出：①開放臂和封閉臂的總進(jìn)入次數(shù)，即OE+CE，表示小鼠的運動活力；②開放臂進(jìn)入次數(shù)比例(OE%)，即〔OE/(OE+CE)〕×100%；③開放臂時間比例(OT%)，即〔OT/(OT+CT)〕×100%。每只小鼠測試5 min，其間用10%乙醇溶液擦拭迷宮清除動物遺跡，并用干布擦凈后再進(jìn)行下1只小鼠的測試。

1.4.2.2熒光PCR實驗結(jié)束后，快速斷頭處死小鼠，迅速在冰盤上剪開顱蓋和腦膜，分離海馬，用于提取組織總RNA。①總RNA提取按Trizol法的操作規(guī)程提取組織總RNA后純化、反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)：20 μl反應(yīng)體系。操作步驟及條件：總RNA 1 μl(約3 μg)，1 μl自由引物，10 μl無菌DEPC處理水，70℃加熱5 min，迅速插入冰中冷卻。再依次加入：4 μl 5×反應(yīng)緩沖液，2 μl dNTP，1 μl RNase抑制劑，37℃加熱5 min。再加入：1 μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U)，42℃，1 h 30 min；72℃反應(yīng)10 min。所得cDNA于-20℃凍存。②引物設(shè)計及合成GABAAR正義鏈：5′-CATGAGGTTGACCGTGAGA-3′；GABAAR-反義鏈：5′-CTACAACCACTGAACGGGCT-3′；β-actin-正義鏈：5′CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′；β-actin反義鏈：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。以上引物均由上海生工有限公司提供。③檢測每個樣本每個指標(biāo)3個孔，共30 μl體系，每孔10 μl。體系組成：1 μl Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，0.5 μl引物A(10 μmol/L)，0.5 μl引物B(10 μmol/L)，13 μl PCR H2O。定量PCR擴增程序：50℃2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，檢測熒光，共40個循環(huán)。RT-PCR實驗結(jié)果采用2-ΔCt法，計算目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0軟件采用單因素方差分析及Tamhan分析。

2結(jié)果

2.1高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠十字迷宮實驗的影響由表1可知，與模型組OE+CE比較，4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.614，P<0.01)，4%高鹽飲食組與8%高鹽飲食組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組OE%比較，4%高鹽飲食組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組OT %比較，4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=50.906，P均<0.01)。

2.2高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠海馬腦GABAAR mRNA的影響與空白組GABAAR mRNA情況(0.271×10-2±0.042)比較，模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組均有統(tǒng)計學(xué)意義(0.155×10-2±0.220、0.019 6×10-2±0.006、0.030 3×10-2±0.005,P<0.05)；與模型組比較，4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；4%高鹽飲食組與8%高鹽飲食組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠十字迷宮

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

3討論

焦慮癥主要表現(xiàn)為發(fā)作性或持續(xù)性的焦慮、緊張、驚恐不安等焦慮情緒，并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張與運動不安等癥狀〔1〕。研究表明，我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標(biāo)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過世界衛(wèi)生組織2006年推薦人均日攝入5 g食鹽及我國居民膳食指南推薦我國人均日攝入量6 g〔4〕。食鹽量的超標(biāo)會導(dǎo)致一系列的疾病，目前主要集中在高血壓、骨質(zhì)疏松等方面，未見高鹽飲食對更年期焦慮癥影響的報道。焦慮癥的發(fā)病機制尚未完全明確，在生化機制方面，主要有神經(jīng)遞質(zhì)假說和神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂假說〔1〕。但焦慮障礙的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)遞質(zhì)(如單胺神經(jīng)遞質(zhì)、γ-GABA)等關(guān)系密切。其中γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動物和昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性遞質(zhì)，其傳遞作用由GABA受體介導(dǎo)，GABA受體分為3個藥理學(xué)亞型，即GABAA受體、GABAB受體和GABAC受體，GABAAR受體是三類受體中最重要的一種，它的功能障礙與神經(jīng)和精神紊亂疾病密切相關(guān)〔5〕。GABAAR是一種多功能藥物作用靶標(biāo)，它可以介導(dǎo)抗焦慮藥、鎮(zhèn)靜劑、抗驚厥藥、 肌肉松弛和失憶作用〔6〕。王麗麗等〔7〕發(fā)現(xiàn)噪音組小鼠GABAAα1/GABAAα3比例下降，慢性持久的噪音暴露使小鼠產(chǎn)生低焦慮樣行為。朱偉等〔8〕研究冬蟲夏草口服液對焦慮小鼠行為干預(yù)效果，結(jié)果顯示與生理鹽水組比較，地西泮組及高劑量蟲草紺的山清GABA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與低劑量蟲草組比較，高劑量蟲草組血清GABA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與地西泮組比較，高劑量蟲草組血清GABA水平差異顯著。周奇志等〔9〕采用不可預(yù)知的情緒應(yīng)激刺激方法建立CES焦慮模型，電針進(jìn)行干預(yù)，運用用免疫組化法檢測兩腦區(qū)GABA的表達(dá)，結(jié)果顯示模型組較空白組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)GABA平均光密度(AOD)值明顯降低；電針可上調(diào)模型大鼠兩腦區(qū)GABA表達(dá)。本研究選擇高架十字迷宮造模，EPM為國際公認(rèn)的測試動物焦慮行為的首選模型，它利用動物對新奇環(huán)境的探究習(xí)性與對高懸敞開臂的恐懼，形成動物的矛盾沖突心理，通過動物的行為表現(xiàn)考察動物的焦慮情緒〔10〕。本實驗結(jié)果顯示提示高鹽飲食可加重動物焦慮程度，減少其活動次數(shù)，具有加重焦慮的作用，可能與影響神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達(dá)有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1秦莉花，李晟，葉麗芝，等.高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運體2、鈉-鉀-氯離子轉(zhuǎn)運體1表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(2)：270-2.

2黃寬，葉麗芝，李晟，等.高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠的行為學(xué)的影響〔J〕.湖南中醫(yī)雜志，2013；29(12)：130-2.

3崔同樣，黃靜，郭海寧.我國居民食用食鹽的研究分析〔J〕.內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報，2011；26(B07)：189-91.

4孔秋玲，鄒江冰，蔣琳蘭.焦慮癥的生化病理機制研究進(jìn)展〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2011；32(21)：2869-71.

5郝艷麗，巨修練.GABAAR研究進(jìn)展〔J〕.武漢華工學(xué)院學(xué)報，2006；28(2)：11-6.

6Rosah TW，Validation of GABAA receptor subtypes as potential drug targets by using genetically modified mice〔J〕.Curr Drug Targ CNS Neurol Disord，2003；(4)：207-13.

7王麗麗，孟博，顧怡然，等.慢性噪音暴露誘發(fā)小鼠低焦慮樣行為及其分子機制的研究〔J〕.復(fù)旦學(xué)報：自然科學(xué)版，2011；50(3)：352-9.

8朱偉，張慧，汪家春，等.冬蟲夏草口服液抗小鼠焦慮作用的實驗研究〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2011；57(9)：68-70.

9周奇志，趙紀(jì)嵐，蔡定均.針對慢性情緒應(yīng)激焦慮大鼠中樞單胺遞質(zhì)與γ-氨基丁酸失平衡的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2008；10：926-9.

10楊紅菊，趙楠，龔正華，等.吲哚衍生物I20的抗焦慮作用及機制研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2002；18(4)：422-5.

〔2014-08-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：秦莉花(1980-)，女，講師，博士，主要從事更年期相關(guān)疾病的研究。

基金項目：湖南省教育廳科研項目(No.12C0253)；湖南省“中藥學(xué)”重點學(xué)科資助(No.湘教通〔2011〕76號)

〔中圖分類號〕R271.19

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0811-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.018