淫羊藿苷對阿爾茨海默病細胞模型糖原合成酶激酶-3β表達的影響及機制

鄭桃林　王　哲　劉　超　何　偉

(解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南　長沙　410003)

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淫羊藿苷對阿爾茨海默病細胞模型糖原合成酶激酶-3β表達的影響及機制

鄭桃林王哲1劉超何偉

(解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410003)

〔摘要〕目的研究淫羊藿苷(ICA)對阿爾茨海默病(AD)細胞模型糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)表達的影響及機制。方法以Aβ25~35孵育PC12細胞制備的AD細胞模型為研究對象，分為對照組、β-淀粉樣蛋白(Aβ)組、ICA組、PI3K/Akt信號通路的經(jīng)典抑制劑(LY)組、ICA+LY組，Western印跡法檢測各組的蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表達。結果與對照組相比，Aβ組的p-Akt水平、p-GSK-3β水平明顯下降(P<0.01)。與Aβ組相比，ICA組的p-Akt水平、p-GSK-3β水平明顯增高(P<0.01)。與ICA組相比，ICA+ LY組p-Akt水平、p-GSK-3β水平明顯下降(P<0.01)。結論ICA可能通過PI3K/Akt信號通路，上調(diào)p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達，發(fā)揮其保護作用。

〔關鍵詞〕淫羊藿苷；阿爾茨海默??；糖原合成酶激酶3β；PI3K/Akt信號通路；蛋白激酶B(Akt)

1中南大學湘雅二醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：鄭桃林(1977-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的診斷及治療研究。

β-淀粉樣肽(Aβ)沉積以及tau蛋白磷酸化、老年斑(SP)形成、神經(jīng)元纖維纏結(NETS)是阿爾茨海默病(AD)的病理學特征。糖原合成酶激酶(GSK)-3β是一種通過磷酸化作用的糖原合成的關鍵調(diào)節(jié)酶〔1,2〕。GSK-3β是為數(shù)不多的通過磷酸化而失活的蛋白激酶之一，磷酸化后其活性明顯降低〔1〕，GSK-3β被認為參與了有淀粉樣前體蛋白(APP)生成Aβ以及tau蛋白磷酸化過程。近來研究結果顯示，GSK-3β能使tau蛋白多個位點磷酸化〔3〕。有動物研究結果顯示：GSK-3β極有可能是AD腦中引起tau蛋白異常磷酸化的最關鍵的激酶之一〔4，5〕，抑制GSK-3β的活性，可能成為治療AD的關鍵靶點。淫羊藿苷(ICA)是一種從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學研究ICA具有多方面的藥理作用，如增加心腦血流量，延緩腎衰竭、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老等作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，在含有淫羊藿的中藥復方腦靈湯的研究中，發(fā)現(xiàn)腦靈湯能抑制AD模型動物海馬內(nèi)GSK-3β的表達以及能改善其學習記憶功能〔7，8〕，但具體機制尚不清楚。本研究探討ICA對Aβ引起的細胞存活率的影響及其部分機制。

1材料和方法

1.1材料PC12細胞購自中國醫(yī)學科學院。ICA由中國食品藥品鑒定研究院提供。Aβ25~35購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自江蘇碧云天生物科技研究所，胎牛血清購自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購自Solarbio公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自美國Jackson公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學發(fā)光顯色試劑盒均購自江蘇碧云天生物科技研究所。

1.2方法

1.2.1PC12細胞的培養(yǎng)PC12細胞的培養(yǎng)液成分為90%高糖DMEM培養(yǎng)基(含青霉素及鏈霉素濃度均為100 U/ml)和10% 胎牛血清。二氧化碳培養(yǎng)箱中條件設置為37℃、5%CO2、飽和濕度。更換細胞培養(yǎng)液頻率約為2~3 d/次，待細胞達70%~80%豐度時進行傳代。藥物干預及各項指標檢測均取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2Aβ25~35孵育PC12細胞制備AD細胞模型將1 mg純度為97%的Aβ25~35溶于雙蒸水中使其終濃度為1 μmol/ml。放置于-20℃冰箱備用。臨用前至于37℃孵育1 w，使其凝聚。取對數(shù)生長期的PC12細胞調(diào)節(jié)其細胞濃度1×105/ml。取調(diào)節(jié)好濃度細胞培養(yǎng)液約2 ml接種于6孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后加入Aβ繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細胞。

1.2.3實驗分組對照組、Aβ組、ICA組、PI3K/Akt信號通路的經(jīng)典抑制劑(LY)組、LY+ICA組。除對照組外，余下四組Aβ的濃度均為20 μmol/L；ICA組：先加ICA孵育1 h后再加Aβ，ICA濃度為20 μmol/L。LY組的LY294002濃度為50 μmol/L；LY+ICA組為先加LY294002濃度為50 μmol/L孵育1 h，再加ICA和Aβ使其濃度為20 μmol/L。LY294002為PI3K/Akt信號通路經(jīng)典抑制劑。

1.2.4Western印跡方法將細胞收集于干凈Ep管中，取蛋白裂解液按每1×106個細胞加200 μl蛋白裂解液。RIPA裂解液處理細胞，提取細胞總蛋白。Bradford 法測定各組樣品蛋白質(zhì)含量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用抗體孵育和顯色，將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進行灰度分析。

1.2.5Western印跡條件說明電泳：濃縮膠50 V，分離膠100 V，電泳時間大概3 h左右；轉(zhuǎn)膜：GSK3B，P-GSK3B 380 mA 1.5 h；封閉：5%脫脂牛奶(TBST稀釋)，37 ℃ 2 h；一抗孵育：4℃孵育過夜(TBST稀釋，Akt、p-Akt 1∶500，GSK-3β、p-GSK-3β 1∶500，β-actin 1∶2 000)；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；二抗孵育：室溫1 h(TBST稀釋，羊二抗 1∶5 000，兔二抗1∶4 000、鼠二抗1∶2 000)；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；顯影：曝光時間，2~10 min。

2結果

2.1各組 Akt與p-Akt蛋白表達水平的比較與對照組相比，Aβ組p-Akt水平明顯下降(P<0.01)；與Aβ組相比，ICA組p-Akt水平明顯增高(P<0.01)；與ICA 組相比，ICA+LY組p-Akt水平明顯下降(P<0.01)。見表1，圖1。

表1　Western印跡法檢測各組Akt磷酸化及GSK-3β

與Aβ組比較：1)P<0.01；與ICA組比較：2)P<0.01；與LY組比較：3)P<0.01

2.2各組GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達水平的比較與對照組相比，Aβ組的p-GSK-3β水平明顯下降(P<0.01)；與Aβ組相比，ICA 組的p-GSK-3β水平增高(P<0.01)；與ICA組相比，ICA+LY組的p-GSK-3β水平明顯下降(P<0.01)。見表1，圖2。

圖1　Western印跡檢測的Akt、p-Akt蛋白表達

圖2　Western印跡法檢測的GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達

3討論

AD發(fā)病機制目前仍不清楚，在眾多關于AD發(fā)病機制的假說中，其中目前被普遍接受的是Aβ級聯(lián)反應假說〔9〕。Aβ級聯(lián)反應假說核心理論：在遺傳或環(huán)境因素改變的情況下，腦內(nèi)生成具有神經(jīng)毒性作用的Aβ，Aβ通過一系列復雜的病理機制導致大腦神經(jīng)元細胞變性、缺失，最終導致認知功能損害，即腦內(nèi)異常沉積的Aβ是造成AD記憶認知損傷的始動因素，是誘發(fā)該病的中心環(huán)節(jié)。GSK-3β是一種通過磷酸化作用而抑制糖原合成酶的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是糖原合成的關鍵調(diào)節(jié)酶〔1,2〕，GSK-3β磷酸化后其活性明顯降低〔1〕。GSK-3β的過度表達可以導致tau蛋白過度磷酸化〔10,11〕，而后者是引起AD的病因之一。因此理論上抑制GSK-3β的活性可能是防治AD的手段。因此本研究從中醫(yī)藥方面探討AD發(fā)病機制，探求AD的有效防治措施。

PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細胞中，參與細胞的生長、增殖以及調(diào)節(jié)細胞分化。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PI3K通過PDK1磷酸化Akt使其活性增強，影響下游凋亡相關蛋白GSK-3β，發(fā)揮抗凋亡等作用〔12〕。PI3K/Akt信號通路可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)的合成及分解〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路是Aβ引起的神經(jīng)元凋亡的重要信號通路〔14〕。GSK-3β是PI3K/Akt通路下游分子，GSK-3β是為數(shù)不多的通過磷酸化而失活的蛋白激酶之一，磷酸化后其活性明顯降低〔1〕，GSK-3β可以通過PI3K/Akt信號通路來進行負性調(diào)節(jié)〔15,16〕。張慧等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預處理后能通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路增加AKt、GSK-3β的磷酸化水平來發(fā)揮抗細胞凋亡作用。亦有研究報道，Akt可以下調(diào)GSK-3β的活性〔18〕，其作用機制可能是Akt可以促進GSK-3β末端的絲氨酸磷酸化而使其滅活，阻止其對下游底物的促凋亡蛋白caspase-9以及caspase-3的磷酸化而起到抗凋亡作用。本實驗提示Aβ可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制GSK-3β活性。

GSK-3β與AD的發(fā)病機制、病理以及治療有著密切的聯(lián)系。近來研究表明，GSK-3β可以使tau蛋白多個位點磷酸化〔19〕。NETS后導致神經(jīng)突觸可塑性下降，突觸可塑性包括突觸形態(tài)的可塑性及突觸功能的可塑性。GSK-3β還可以通過磷酸化減少轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)錄因子在突觸重塑、長期記憶的形成以及抗凋亡方面可以起到重要作用。因此，可以推測，增加GSK-3β的活性可以引起突觸可塑性障礙〔20〕。GSK-3β的活性異常升高被認為可以誘導神經(jīng)突觸的可塑性損傷以及神經(jīng)元的凋亡，這些均可能與AD的部分發(fā)病機制有關。因此，目前研究GSK-3β抑制劑治療AD被認為很有前景的治療靶點。李寧等〔21〕報道，GSK-3β已經(jīng)成為治療AD藥物作用的一個重要潛在靶點。研究GSK-3β的調(diào)節(jié)機制以及在疾病狀態(tài)下GSK-3β的調(diào)節(jié)如何被破壞，對于治療AD至關重要，也是目前研究的熱點。本實驗提示Aβ 能明顯下調(diào)PC12細胞中p-GSK-3β蛋白表達水平，ICA有拮抗Aβ引起的細胞存活率下降的作用，對AD細胞有神經(jīng)保護作用。GSK-3β磷酸化水平增高可能是通過激活了上游的Akt活性而起到的作用。加入Akt抑制劑后，與LY組比較，ICA +LY組GSK-3β磷酸化水平明顯增高，提示ICA可能通過多途徑、多靶點、多層次發(fā)揮細胞保護作用，其機制有待進一步研究。

淫羊藿是祖國傳統(tǒng)補益中藥，具有溫陽補腎、強筋健骨、祛風除濕等功效。ICA是一種從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學研究ICA具有多方面的藥理作用，其生物學作用有多種，如增加心腦血流量，延緩腎衰竭、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老等作用〔6〕。前期研究報道：在選用含有淫羊藿的中藥復方腦靈湯的研究中，腦靈湯能減輕AD模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，能對AD模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元具有保護作用，能恢復和改善其學習記憶功能〔7，8〕。聶晶等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)ICA可以改善海馬內(nèi)注射Aβ25~35所致AD模型大鼠的學習記憶能力。但是否通過激活PI3K/Akt，上調(diào)其下游分子GSK-3β的表達，目前較少有相關報道。

文獻報道抑制GSK-3β活性可能對防治AD有效〔23~25〕。在AD中，過度激活GSK-3β可以使tau蛋白過度磷酸化，也可以使Aβ產(chǎn)生增多〔25〕。因此，推測ICA可能通過PI3K/Akt信號通路抑制GSK-3β活性，發(fā)揮抗癡呆作用。

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〔2014-08-11修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：湖南省中醫(yī)藥科研項目重點課題(No.M201225)

〔中圖分類號〕R741.02

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0800-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.013