失代償期乙型肝炎肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細胞對自體外周血淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T細胞亞群增殖的影響

張　笛　晉瓊玉

(四川省醫(yī)學科學院　四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川　成都　610072)

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失代償期乙型肝炎肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細胞對自體外周血淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T細胞亞群增殖的影響

張笛晉瓊玉1

(四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川成都610072)

〔摘要〕目的研究乙型肝炎肝硬化失代償期患者骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)對其外周血中淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞亞群(Tregs)增殖的影響。方法12例乙型肝炎肝硬化失代償期患者骨髓分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，采用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)后的貼壁細胞形態(tài)、采用流式細胞儀技術(shù)觀察間充質(zhì)細胞免疫表型；在植物血凝素(PHA)刺激下、自體血清作為培養(yǎng)基，實施BMSCs和患者自體外周血淋巴細胞共培養(yǎng)，分為A組(BMSCs+淋巴細胞+PHA接觸培養(yǎng))、B組(BMSCs+淋巴細胞+PHA非接觸培養(yǎng))、C組(淋巴細胞+PHA培養(yǎng))、D組(淋巴細胞)，均72 h后觀察BMSCs對外周血淋巴細胞增殖及Tregs細胞表達的影響。結(jié)果流式細胞儀分析結(jié)果顯示：培養(yǎng)3代后的間充質(zhì)干細胞主要高表達T細胞亞群(Tregs)中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表達CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。 C組淋巴細胞增殖率顯著高于A、B、D組(P<0.05),A、B兩組顯著高于D組(P<0.05),但A、B兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 A、B、C組Tregs細胞表達率顯著高于D組(P<0.05),A、B兩組顯著高于C組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論乙型肝炎肝硬化失代償期患者BMSCs對其外周血中淋巴細胞增殖具有抑制作用、同時調(diào)上調(diào)T細胞亞群表達，BMSCs可能具有免疫抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕乙型肝炎肝硬化；失代償期；骨髓間充質(zhì)干細胞；淋巴細胞；調(diào)節(jié)性T細胞

1四川省郫縣人民醫(yī)院內(nèi)科

第一作者：張笛(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性肝病研究。

充質(zhì)干細胞為中胚層或者外胚層來源的具有多向分化潛能的干細胞，在部分誘導因子的刺激下可以分化為脂肪、肌肉、骨骼及部分內(nèi)臟器官組織，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)為最早發(fā)現(xiàn)的多向分化潛能干細胞，具有自我增殖、免疫調(diào)節(jié)、促進造血及促進干細胞植入的作用〔1,2〕，近年來部分學者通過BMSCs治療失代償期肝硬化，并認為BMSCs可以通過在肝臟組織細胞損傷部位重新分化增殖為正常干細胞，進而促進肝臟新生組織細胞再生，改善患者的臨床癥狀〔3,4〕。BMSCs對于局部肝臟細胞免疫抑制及抗炎作用可能發(fā)揮了較為重要的作用，本文擬通過了解乙肝肝硬化失代償期患者BMSCs對其外周血中淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞亞群(Tregs)增殖的影響，進一步了解BMSCs對乙肝肝硬化失代償期患者治療的作用機制。

1資料與方法

1.1一般資料2014年3~12月12例乙肝肝硬化失代償期患者，男8例，女4例，年齡52～71歲，平均(64.2±8.7)歲，肝功能Child-Pugh評分(12.6±2.3)分，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)(33.6±21.5)U/L，總膽紅素(TBIL)(42.2±22.7)μmol/L。符合2010 年版“慢性乙型肝炎防治指南”中關(guān)于失代償期乙型肝炎肝硬化的診斷標準；近期未使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物；均知情同意。

1.2實驗儀器與藥品兔抗CD44、CD29、CD34及CD25抗體均購自南京凱基生物科技有限公司，間充質(zhì)干細胞及淋巴細胞分離液購自江蘇太生生物科技有限公司。

1.3檢測方法卵巢細胞株培養(yǎng)至融合度為50%時，接種于干細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育24 h后用胰蛋白酶消化液〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化細胞，離心收集細胞后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次(2 000 r/min，5 min)，加入CD44、CD29、CD34及CD25抗體，室溫孵育20 min，生理鹽水洗滌3次，每次5 min，流式細胞儀上機檢測各標記抗體細胞群分布。

1.4統(tǒng)計學方法應(yīng)用SAS9.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)結(jié)果鑒定均成功分離培養(yǎng)出原代BMSCs，培養(yǎng)至第3代，其純度可達到95%，BMSCs細胞多于12 h后開始貼壁生長，倒置顯微鏡下觀察可見BMSCs呈貼壁梭形、多角，呈平行排列或呈漩渦狀，見圖1。培養(yǎng)3代后的BMSCs主要高表達Tregs中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表達

CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。見圖2。

2.2BMSCs對外周血淋巴細胞增殖的影響作用C組淋巴細胞增殖率(63.18%±8.14%)顯著高于A(32.57%±6.84%)、B(34.72%±5.25%)、D組(5.26%±1.74%)(F=28.93，P<0.001),A、B兩組顯著高于D組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3BMSCs對外周血Tregs細胞亞群的影響作用A、B、C組Tregs細胞表達率(48.05%±9.22%、46.25%±7.20%、21.47%±5.50%)顯著高于D組(4.26%±1.52%)(F=21.096，P<0.01),A、B兩組顯著高于C組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1　BMSCs原代培養(yǎng)(倒置顯微鏡，×40)

圖2　流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原分子

3討論

肝硬化晚期可表現(xiàn)為腹水、低蛋白血癥、凝血功能障礙及較為嚴重的門脈高壓癥狀，部分患者可因肝性腦病的發(fā)生而引起病死率的上升〔5〕。近年來BMSCs已廣泛應(yīng)用于治療失代償期肝硬化，考慮BMSCs可以通過抑制IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥趨化因子進而抑制級聯(lián)式的炎癥反應(yīng)，并通過抑制Toll樣受體四種亞型進而抑制其進入干細胞線粒體導致的細胞凋亡，另外部分學者認為BMSCs可對金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-9及MMP-6的生成調(diào)節(jié)，進而促進細胞外纖維成分的降解，減輕纖維化的肝臟組織〔6,7〕。但迄今為止，對于BMSCs對免疫調(diào)節(jié)機制的探討較少，僅有部分學者通過建立動物模型進而發(fā)現(xiàn)BMSCs可以通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+T淋巴細胞及TH1/TH2淋巴細胞平衡，進而參與失代償期肝硬化的治療過程〔8〕，Yu等〔9〕通過雌激素刺激BMSCs治療的肝硬化組織后發(fā)現(xiàn)，其細胞內(nèi)Toll樣受體3的表達明顯上調(diào)，并認為雌激素可能通過抑制雌激素受體(ER)/Cyclin信號通路進而參與抑制IL-6炎癥介導的級聯(lián)炎癥反應(yīng)。

部分學者認為在失代償性肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，D44+CD29+Treg干細胞呈現(xiàn)出了降低的趨勢，但并無明顯的相關(guān)實驗室指標如血清白蛋白及凝血功能指標的依賴性〔10〕，本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3代后的間充質(zhì)干細胞主要高表達Tregs中的CD44+CD29+，證實了MSCs可能通過逆轉(zhuǎn)或者恢復(fù)CD44+CD29+Treg淋巴細胞進而促進干細胞再生，在BMSCs的刺激下淋巴細胞的增殖能力并不依賴植物血凝素的影響，貼壁或者不貼壁生長均不能顯著影響淋巴細胞的增殖效能，考慮BMSCs對于淋巴細胞增殖的影響可能通過可溶性細胞因子如可溶性雌激素末端磷酸化產(chǎn)物而起效〔11〕，而無BMSCs刺激的淋巴細胞增殖率明顯增高，提示了BMSCs對于淋巴細胞增殖率的抑制作用，這與Xu等〔12〕認為的BMSCs通過抑制除了抗原提呈細胞(APC)在內(nèi)的多數(shù)淋巴細胞增殖進而促進局部細胞再生觀點較為相似。另外，BMSCs對外周血Tregs細胞亞群的影響較為明顯，提示BMSCs對于Tregs細胞表達的上調(diào)作用，Xu等〔12〕認為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β及IL-10的調(diào)節(jié)作用參與免疫抑制過程，Jang等〔10〕通過探討35例肝硬化患者的臨床資料后也認為，Tregs細胞表達陽性率伴隨了肝硬化門靜脈高壓期發(fā)展的全過程。

綜上所述，BMSCs對于乙肝肝硬化失代償期患者外周血中淋巴細胞增殖具有抑制作用，同時可上調(diào)Tregs細胞表達陽性率，可能進而發(fā)揮其促進肝細胞再生及緩解肝纖維化的作用。本次研究的例數(shù)較少，需進一步擴大研究樣本。

4參考文獻

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〔2014-11-23修回〕

(編輯苑云杰)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on proliferation and Tregs subsets of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis B cirrhosis

ZHANG Di,JIN Qiong-Yu.

Department of Gastroenterology，Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on the value of T cells in the peripheral blood of patients with cirrhosis of liver cirrhosis.Methods12 patients with hepatitis B liver cirrhosis decompensation period were selected,and their BMSCs were separated and cultured.Adherent cells morphology were observed by inverted microscope,immunophenotype of BMSCs were detected by flow cytometry instrument technique.BMSCs and autologous peripheral blood lymphocytes were co-cultured in autologous serum and phytohemagglutinin(PHA)stimulation.Groups were divided into:group A(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture in contact),group B(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture non-contact),group C(lymphocytes +PHA culture),and group D(lymphocytes).Effects of BMSCs on peripheral blood lymphocyte proliferation and Tregs were observed after cultured for 72 h.ResultsFlow cytometric analysis results showed that the culture after 3 generations of mesenchymal stem cells mainly highly expressed T cell subsets(Tregs)of CD44(95.26%),CD29-(92.18%)and lowly expressed CD34(1.27%),CD25(1.33%).Lymphocyte proliferation rate in Group C was significantly higher than that of group A,B and D(P<0.05).Lymphocyte proliferation rate in Group A,B was significantly higher than that of group D(P<0.05).There was no significant difference in lymphocyte proliferation rate between group A and B(P>0.05).Tregs expression rate in group A,B and C was significantly higher than that of group D(P<0.05),Tregs expression rate in group A,B was significantly higher than that of group C(P<0.05).There was no significant difference in Tregs expression rate between group A and B(P>0.05).ConclusionsBMSCs in the patients with chronic hepatitis B cirrhosis decompensation period have inhibition effect on the proliferation of peripheral blood,and could up-regulate the expression of T cells in the same time.BMSCs might have immunosuppressive effect.

【Key words】Hepatitis B cirrhosis;Decompensation;Bone marrow mesenchymal stem cells;Lymphocytes;Regulatory T cells

基金項目：國家自然科學基金項目(No.50063753)；四川省衛(wèi)生廳基金項目(No.110184)

〔中圖分類號〕R575.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0792-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.009