青藤堿注射液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液及血清細(xì)胞因子水平的影響

安永博　路　坦　宗海斌

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外二科，河南　新鄉(xiāng)　453100)

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青藤堿注射液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液及血清細(xì)胞因子水平的影響

安永博路坦宗海斌1

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外二科，河南新鄉(xiāng)453100)

〔摘要〕目的觀察青藤堿注射液對兔膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)關(guān)節(jié)液及血清細(xì)胞因子水平的影響。方法日本大耳雄性白兔80只隨機(jī)分為空白對照組，模型組，青藤堿組，陽性藥(曲安奈德)組，每組20只。每周觀察兔膝骨關(guān)節(jié)大體變化，并進(jìn)行肉眼及鏡下的兔膝關(guān)節(jié)評分，采用ELISA測定兔血清及關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子包括白介素(IL)-1β，IL-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平。結(jié)果與空白對照組相比，模型組以及陽性藥組、青藤堿組兔關(guān)節(jié)腫脹程度均顯著增高(P<0.05)，在隨后的治療過程中，三組均始終高于空白對照組(P<0.05)，在治療第1周，肉眼見模型組，陽性藥組，青藤堿組兔膝關(guān)節(jié)均呈現(xiàn)高度腫脹，其圍度測量數(shù)值無差異(P>0.05)，隨著治療的時間延長，陽性藥組以及青藤堿組兔膝關(guān)節(jié)逐漸消腫，根據(jù)測量圍度，在第2~5周其圍度均小于模型組(P<0.05)，而陽性藥組以及青藤堿組間差異不大(P>0.05)。隨著治療，陽性藥組及青藤堿組每周圍度均小于上周測量數(shù)值，至第4周陽性藥組以及青藤堿組治療進(jìn)入平穩(wěn)期，第5周與第4周兩組兔膝關(guān)節(jié)圍度測量結(jié)果相比無差異(P>0.05)。肉眼評分及鏡下評分顯示治療第1周時，模型組、陽性藥組以及青藤堿組與空白對照組相比評分顯著增高(P<0.05)，三組間無差異(P>0.05)，隨著治療過程，模型組評分變化不大，陽性藥組以及青藤堿組評分逐漸下降在治療第2周時評分顯著低于模型組(P<0.05)，兩組間無差異(P>0.05)，之后青藤堿組與陽性藥組與模型組評分差異逐漸增大，評分仍高于空白對照組(P<0.05)，兩組間無差異(P>0.05)，至治療第5周，陽性藥組與青藤堿組與治療第4周時組內(nèi)評分變化無差異(P>0.05)。血清及兔膝骨關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，模型組，青藤堿組以及陽性藥組治療前后IL-1β，IL-6，TNF-α的表達(dá)水平始終高于空白對照組(P<0.05)，但青藤堿組以及陽性藥組高出程度不及模型組，青藤堿組以及陽性藥組IL-1β，IL-6，TNF-α的表達(dá)低于模型組(P<0.05)，而陽性藥以及青藤堿組間無差異(P>0.05)。結(jié)論青藤堿可通過降低兔血清及膝關(guān)節(jié)液中炎癥細(xì)胞因子的水平達(dá)到治療膝OA的作用。

〔關(guān)鍵詞〕青藤堿注射液；曲安奈德；膝關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞因子

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室

第一作者：安永博(1987-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事骨外科研究。

膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)臨床上治療多以緩解疼痛，改善患者關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量為主〔1，2〕，但是口服抗炎藥物往往對患者自身造成其他不良影響，如損壞胃黏膜，對肝腎功能的不良影響等〔3〕。關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射藥物是一種不僅起效較快且副作用相對較少的治療方式〔4〕，青藤堿注射液是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體鹽酸鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于嗎啡，具有抗炎，抑制免疫，鎮(zhèn)痛等作用〔5〕。本研究觀察青藤堿注射液對兔膝關(guān)節(jié)OA的臨床療效及對血清及關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1材料及方法

1.1動物、藥品、試劑及儀器選擇健康4~6月齡日本大耳雄性白兔80只，體重2.4~2.6 kg，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證編號：SCXK(豫)2010-0001，在三級動物室無菌飼料喂養(yǎng)。高速冷凍離心機(jī)(德國賀利氏)、超低溫冰箱、高倍數(shù)電子顯微鏡、圖像分析系統(tǒng)等設(shè)備。青藤堿注射液(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號：050912032)；醋酸曲安奈德注射液(昆明積大制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H53021064)；木瓜蛋白酶溶液〔木瓜蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品(進(jìn)口分裝)，購自湖南麗欣生物有限公司，批號：P3250〕。兔白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA 酶聯(lián)免疫檢測試劑(批號：0510094，上海西唐生物科技有限公司提供)。

1.2方法

1.2.1模型的分組、復(fù)制與給藥實(shí)驗(yàn)動物自由飲食，無不良因素影響，飼養(yǎng)2 d以適應(yīng)環(huán)境，參照文獻(xiàn)選擇木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射制造模型〔6〕，造模前精確測量所有動物右后膝關(guān)節(jié)直徑、該關(guān)節(jié)最大活動度。除留作空白對照組的20只動物外，其余60只動物分別在每周的第 1、4、7 天時于右后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射 4%的木瓜蛋白酶溶液0.3 ml進(jìn)行造模。連續(xù)注射造模4 w后，再次測量造模關(guān)節(jié)的直徑及活動度。將造模成功后的60只兔子隨機(jī)分成三組，模型組，陽性藥組以及青藤堿組，每組20只。所有動物均關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥，按Meeh-Rubner公式計算體表面積〔6〕每只兔子用量約為0.2 ml，所有動物在造模成功后第3天開始局部注射用藥，每7天于各組兔子右后膝關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射藥物，青藤堿組注射0.2 ml青藤堿注射液，陽性藥組注射0.2 ml醋酸曲安奈德注射液，模型組注射0.2 ml無菌生理鹽水，連續(xù)用藥5 w，空白對照組兔子不做任何處理。

1.2.2觀察指標(biāo)及方法

1.2.2.1膝關(guān)節(jié)評分開始治療后，每周隨機(jī)選擇每組4只兔子首先測量關(guān)節(jié)圍度，繼而采用耳緣空氣靜脈栓塞處死法處死，完整取兔子實(shí)驗(yàn)關(guān)節(jié)囊，觀察兔子關(guān)節(jié)軟骨變化。采用肉眼評分法以及鏡下觀察評分法，對每周每組兔子進(jìn)行評分。

1.2.2.2關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子檢測按畢氏等介紹的關(guān)節(jié)沖洗液抽取方法，于造模前以及實(shí)驗(yàn)后，向兔子的左后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.9%無菌氯化鈉注射液0.5 ml，人工手動充分活動兔子的膝關(guān)節(jié)使其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)與關(guān)節(jié)滑液充分混合，再抽取關(guān)節(jié)腔洗液0.5 ml，2 000 r/min離心10 min后，取上清液于-20℃中保存檢驗(yàn)IL-1、IL-6及TNF-α。

1.2.2.3血清細(xì)胞因子檢測采用耳緣靜脈取血法于造模前以及實(shí)驗(yàn)后，取各組兔子耳緣靜脈血2 ml，離心后分離血清，于-20℃中保存待檢驗(yàn)。

1.2.2.4兔膝關(guān)節(jié)的大體觀察每周固定間隔時間，大體觀察每組兔子的膝關(guān)節(jié)變化并測量關(guān)節(jié)圍度。兔膝關(guān)節(jié)軟骨的肉眼觀察評分及鏡下評分參考文獻(xiàn)〔7〕。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1兔膝關(guān)節(jié)的大體觀察與空白對照組相比，模型組以及陽性藥組、青藤堿組兔關(guān)節(jié)腫脹程度均顯著高于空白對照組(P<0.05)，在隨后的治療過程中，三組均始終大于空白對照組(P<0.05)，在治療第1周，肉眼見模型組，陽性藥組，青藤堿組兔膝關(guān)節(jié)均呈現(xiàn)高度腫脹，其圍度測量數(shù)值無差異(P>0.05)，隨著治療的時間延長，陽性藥組以及青藤堿組兔膝關(guān)節(jié)逐漸消腫，根據(jù)測量圍度，在第2~5周其圍度均小于模型組(P<0.05)，而陽性藥組以及青藤堿組組間無差異(P>0.05)。隨著治療，陽性藥組及青藤堿組每周圍度均小于上周測量數(shù)值，至第4周陽性藥組及青藤堿組治療進(jìn)入平穩(wěn)期，第5周與第4周相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1　各時間點(diǎn)各組兔膝關(guān)節(jié)圍度測量結(jié)果±s,cm,n=20)

與空白對照組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05

2.2兔膝關(guān)節(jié)肉眼評分治療第1周時，模型組、陽性藥組以及青藤堿組與空白對照組相比評分顯著增高(P<0.05)，三組間無顯著差異(P>0.05)，隨著治療時間延長，模型組評分變化不大，陽性藥組以及青藤堿組評分逐漸下降在治療第2周時評分顯著低于模型組(P<0.05)，兩組間無顯著差異(P>0.05)，之后青藤堿組與陽性藥組與模型組評分差異逐漸增大，評分仍高于空白對照組(P<0.05)，兩組間無顯著差異(P>0.05)，至治療第5周，陽性藥組與青藤堿組與治療第4周時無顯著變化(P>0.05)。見表2。

2.3兔膝關(guān)節(jié)軟骨鏡下評分比較治療第1周時，模型組、陽性藥組以及青藤堿組與空白對照組相比評分顯著增高(P<0.05)，三組間無顯著差異(P>0.05)，隨著治療時間延長，模型組評分變化不大，陽性藥組以及青藤堿組評分逐漸下降在治療第2周時評分顯著低于模型組(P<0.05)，之后青藤堿組與陽性藥組與模型組評分差異逐漸增大，仍高于空白對照組(P<0.05)，但兩組間無顯著差異(P>0.05)，至治療第5周，陽性藥組與青藤堿組與治療第4周時組內(nèi)評分變化差異不顯著(P>0.05)。見表3。

2.4各組治療前后兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β，IL-6，TNF-α水平模型組，青藤堿組以及陽性藥組治療前后IL-1β，IL-6，TNF-α水平始終高于空白對照組(P<0.05)，但青藤堿組以及陽性藥組高出程度不及模型組，青藤堿組以及陽性藥組IL-1β，IL-6，TNF-α的水平低于模型組(P<0.05)，而陽性藥組及青藤堿組無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表2　各組兔膝關(guān)節(jié)肉眼評分比較±s，分,n=4)

與空白對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與本組前一時間點(diǎn)比較：3)P<0.05，下表同

表3　各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨鏡下評分比較±s，分,n=4)

表4　各組治療前后兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β，IL-6，TNF-α的水平比較

2.5各組治療前后兔血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平模型組，青藤堿組以及陽性藥組治療前后IL-1β，IL-6，TNF-α的表達(dá)水平始終高于空白對照組(P<0.05)，但青藤堿組以及陽性藥組高出程度不及模型組，青藤堿組與陽性藥組IL-1β，IL-6，TNF-α的水平低于模型組(P<0.05)，而陽性藥組與青藤堿組無顯著差異(P>0.05)。見表5。

表5　各組治療前后兔血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平比較

3討論

膝OA嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能，患者常感到劇痛，影響行動，因此嚴(yán)重影響生活質(zhì)量〔8〕。流行病學(xué)研究顯示，影像學(xué)診斷支持的女性膝OA患病率明顯高于男性，雖然隨著年齡增長,男女各自的患病率呈升高趨勢，但是女性發(fā)病人群仍然要高于男性〔9〕。目前認(rèn)為本病的發(fā)病機(jī)制與關(guān)節(jié)軟骨上壓力形式及強(qiáng)度有關(guān)，隨著患者年齡的增加，創(chuàng)傷，沖擊力，關(guān)節(jié)負(fù)荷過度，勞損以及衰老都可加速關(guān)節(jié)軟骨損傷，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的組成，結(jié)構(gòu)及性質(zhì)發(fā)生改變。而關(guān)節(jié)軟骨是作為承載兩活動骨之間的物質(zhì)，主要成分為水以及膠原纖維，具有延伸特性，隨著年齡的變化，其組織表面隨張力將城鄉(xiāng)不均勻分布并逐漸發(fā)生變化〔10〕。還有研究認(rèn)為糖基化終末產(chǎn)物積聚可增加膝關(guān)節(jié)軟骨的脆性，同時增加了膝關(guān)節(jié)組織老化，斷裂的風(fēng)險，隨著年齡增長，其發(fā)生生物力學(xué)功能障礙的可能性也在逐漸增加，會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨受損〔11〕。在正常的人體生理?xiàng)l件下，由細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生的各種成分組成一個穩(wěn)定生理環(huán)境〔12〕，維持軟骨細(xì)胞緩慢的新陳代謝，使其保持平衡，當(dāng)軟骨遭受生理，物理刺激下，狀態(tài)會失衡，導(dǎo)致發(fā)生一些變化，如炎癥發(fā)生，釋放的細(xì)胞因子會導(dǎo)致軟骨內(nèi)環(huán)境改變，促進(jìn)軟骨成分變化，降解的發(fā)生。當(dāng)膝OA發(fā)生時，IL-1β，IL-6，TNF-α表達(dá)升高。有研究表明炎癥因子是軟骨降解強(qiáng)有力的激活物，可促進(jìn)軟骨破壞及降解〔13〕。且在軟骨的合成過程中，白介素家族如IL-1β，IL-6充當(dāng)退化性細(xì)胞因子的角色，阻止軟骨的合成，而TNF-α是致炎因子，導(dǎo)致軟骨在高炎癥應(yīng)激環(huán)境下，因此可阻止軟骨維持正常的合成代謝狀態(tài)〔14〕。

膝OA在中醫(yī)范疇內(nèi)又名痹癥〔15〕，中醫(yī)認(rèn)為本病的基本病機(jī)為風(fēng)邪侵犯，瘀血阻絡(luò)，病理基礎(chǔ)為風(fēng)、濕、寒、瘀等，歷代醫(yī)家以祛風(fēng)除濕，活血化瘀立法〔16〕。膝OA的病變部位在關(guān)節(jié)處，在治療痹癥的眾多藥物中，藤類藥〔17〕因能通經(jīng)絡(luò)，止弊痛，具有搜風(fēng)通絡(luò)直達(dá)患處之功效，故常被眾多醫(yī)家選用。青藤堿注射液是正清風(fēng)痛寧的主要有效成分，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)，消腫止痛作用，臨床可用于風(fēng)寒濕痹證，癥見肌肉酸痛、關(guān)節(jié)腫脹，疼痛，屈伸不利，麻木僵硬及風(fēng)濕與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)具有上述證候者?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究〔18〕表明青藤堿具有鎮(zhèn)痛，抗炎，免疫調(diào)節(jié)等作用，可針對OA的發(fā)病與炎性反應(yīng)，機(jī)械負(fù)荷紊亂，關(guān)節(jié)軟骨營過度破壞，氧自由基干擾，自身免疫反應(yīng)，軟骨和滑膜中炎癥因子增高等具有治療作用，膝OA在臨床上表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛，僵硬，活動受限甚至關(guān)節(jié)畸形，青藤堿的藥理作用與膝OA的發(fā)病機(jī)制相符合，具有治療膝OA臨床依據(jù)。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射已成為針對風(fēng)濕骨病患者常用的治療手段〔19〕，局部作用具有見效快，副作用小等特點(diǎn)，曲安奈德注射液常作為局部注射治療膝骨關(guān)節(jié)炎的一種，其療效在臨床上得到肯定，但由于激素類藥物具有一定局限性〔20〕，針對其副作用等，每年應(yīng)用次數(shù)有限。

本研究首先成功復(fù)制了膝OA模型，動物局部表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)腫脹，活動受限，其次在模型制作過程中，隨著時間延長至第4~5周，膝關(guān)節(jié)腫脹變化逐漸平穩(wěn)，提示模型在這個時間段已經(jīng)是模擬膝OA較為合適的時機(jī)。隨著治療時間的延長各治療組動物膝OA癥狀得到改善，血清及關(guān)節(jié)液中炎癥細(xì)胞因子均明顯下降，而陽性藥組與青藤堿組間無顯著差異，提示青藤堿組與陽性藥組療效相當(dāng)。

綜上所述，青藤堿可對兔膝OA具有治療作用，5 w為1個療程，是否還具有其他相關(guān)治療機(jī)制將是今后研究的方向。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-10-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

s

Effects of Sinomenine injection on knee osteoarthritis fluid and serum cytokines of rabbit

AN Yong-Bo,LU Tan,ZONG Hai-Bin.

Department of No.2 Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453100，Henan，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Sinomenine injection treatment on knee osteoarthritis fluid and serum cytokines of rabbit.MethodsMale Japanese big ear rabbits were randomly divided into blank control,model,Sinomenine,positive drugs(triamcinolone acetonide)groups,20 in each group.Rabbit knee joint was observed weekly,naked eye and microscopic rabbit knee score were made.IL-1β,IL-6,TNF-α in serum and knee osteoarthritis fluid were measured by ELISA.ResultsCompared with the blank control group,joint swelling of rabbits were significantly higher in model,positive and Sinomenine groups(P<0.05),in the subsequent course of treatment,joint swelling of rabbits in the three groups were always greater than those of blank control group(P<0.05).In the first week of treatment,rabbit knee showed a high degree of swelling visually in the model,positive drug and Sinomenine groups,there were no significant differences among the three groups(P>0.05).With treatment prolonged,rabbit knee joint swelling in positive drug and Sinomenine groups gradually decreased.According to the measured circumference,rabbit knee joint circumference of positive drug and Sinomenine groups were less than those of model group in the first 2~5 weeks,the differences were significant(P<0.05),while there was no significant difference between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).With treatment prolonged,degrees around each measured value were less than those of last week in positive drug and Sinomenine groups.To the first four weeks,positive drug and Sinomenine groups entered a stable period,there was no significant difference in rabbit knee girth measurement between the fourth and the fifth week in positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).At the first week,macroscopic and microscopic scores of model,positive drug and Sinomenine groups were significantly increased compared with those of control group(P<0.05),but there was no significant differences among the three groups(P>0.05).With the treatment process,score of the model group changed little,the score of positive drug and Sinomenine groups decreased,there were significant differences between treatment groups and model group from the second week(P<0.05),but the score was still higher than that of blank control group(P<0.05),and there was no significant difference between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).Compared with blank control group,levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid in model,positive drug and Sinomenine groups were obviously higher(P<0.05).Compared with model group,levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid in positive drug and Sinomenine groups were lower(P<0.05).There were no significant differences in levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).ConclusionsSinomenine has therapeutic effect on knee osteoarthritis by decreasing serum and rabbit knee osteoarthritis fluid cytokines,five weeks is one course.

【Key words】Sinomenine;Triamcinolone acetonide;Knee osteoarrthritis;Cytokines

基金項(xiàng)目：河南省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(No.201304029)

〔中圖分類號〕R69

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0788-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.008