豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞前部及后極部TGF-β2表達變化的研究

陳博宇 王超英 陳維毅

·實驗研究·

豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞前部及后極部TGF-β2表達變化的研究

陳博宇1王超英1陳維毅3

目的 研究豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞前部及后極部轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)的改變,探索近視的發(fā)病機制。方法 2周齡豚鼠30只隨機分為A、B、C組,每組10只,再隨機選取5只(10眼)正常2周齡豚鼠不作任何干預,作為正常對照眼。選取任意眼戴一10 DS凹透鏡,分別飼養(yǎng)6天、15天、30天后除去鏡片,驗光及測眼軸長度確定近視形成后,采用細胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的前部及后極部RPE細胞,取3～6代RPE細胞進行免疫細胞化學、實時熒光定量PCR、western-blot蛋白印跡法檢查前部及后極部RPE細胞TGF-β2及其mRNA、蛋白表達變化。結(jié)果 TGF-β2的表達定位于細胞漿和細胞核。實驗組中前部RPE細胞于15天陽性表達率較高,30天陽性表達率最高;后極部RPE細胞于6天表達率開始較高,至15天陽性表達率最高,以后保持較高的陽性表達率,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無顯著意義(P>0.05)。結(jié)論 體外培養(yǎng)的豚鼠RPE細胞穩(wěn)定表達TGF-β2、TGF-β2 mRNA及其蛋白。且前部RPE細胞于誘導15天開始陽性表達率較高;后極部RPE細胞于誘導6天開始陽性表達率較高。后極部RPE細胞較前部RPE細胞表達差異有顯著性。

豚鼠; 視網(wǎng)膜色素上皮細胞; 轉(zhuǎn)化生長因子β2; 免疫細胞化學; 實時熒光定量PCR; Western-blot蛋白印跡法

視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞位于視網(wǎng)膜感覺上皮層與脈絡膜之間,聯(lián)系上皮與間充質(zhì),與多種細胞因子的分泌有關(guān),對于穩(wěn)定和維持視網(wǎng)膜功能有重要的作用,并且參與眼內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)作為一種近視發(fā)生的信號分子,由RPE細胞分泌,并通過受體傳遞,逐級將信息傳遞到鞏膜組織,進而影響鞏膜細胞的增殖和(或)細胞外基質(zhì)的合成或降解,使鞏膜重新塑形,眼軸過度延長,形成近視。眾所周知,近視眼形成的病理及生化改變存在的不同部位的差異,其變化主要發(fā)生在后極部,那么是否影響鞏膜重塑的RPE細胞所分泌的因子也存在部位的差異？目前人們對豚鼠透鏡誘導近視眼RPE細胞中TGF-β2的表達變化的研究罕有報道,而不同部位RPE細胞分泌因子的差異更無人報道,為此,本研究在成功建立透鏡誘導近視眼模型的基礎(chǔ)上,定位到前部及后極部RPE細胞,分析不同部位的TGF-β對在近視發(fā)生發(fā)展過程中起所起的作用,為進一步在細胞因子水平,對病理性近視眼發(fā)生機制的研究提供補充和相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 隨機選取2周齡已脫離母乳喂養(yǎng)的小豚鼠30只(60只眼)分為A、B、C組,A組10只,B組10只,C組10只,再隨機選取5只(10眼)正常2周齡豚鼠不作任何干預,作為正常對照眼(Norma-contro,NC組),雌雄不限,由河北醫(yī)科大學實驗動物養(yǎng)殖場提供。制備A、B、C組的LIM動物模型,誘導眼為實驗組(LIM組),對側(cè)眼為自身對照組(SC組)。實驗眼是采用離焦點的方法用-10.00D[1]凹透鏡誘導成近視眼模型。遮蓋時間分別為6天、15天、30天。幼豚鼠于室內(nèi)標準化喂養(yǎng),白天用自然光照射,每日光照與黑暗的周期比例為14:10,室溫控制在20℃。

1.1.2 凹透鏡片(自行設計的 PMMA 鏡片,部分參數(shù)如下:鏡片直徑 11.0mm,光學直徑9.5mm,基弧為9.0,屈光度均為-10.00D上海菲士康視光有限公司)。

1.1.3 試劑

F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibico公司);胎牛血清、小牛血清(杭州四季青公司);培養(yǎng)瓶、六孔板(美國Corning公司)。兔抗鼠Vimentin、Desmin、keratin、S-100I抗及免疫組化的劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)、(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Trozol Invitrogen公司USA;RNase Inhibitor Promega公司USA;M-MLV RT酶Promega公司USA;DNTP Promega公司USA;Taq酶(5u/μl)Sigma公司USA。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

將豚鼠標記編號,驗光及測眼軸長度。將三組豚鼠分別喂養(yǎng)6、15、30天后,摘除鏡片,按前述方法驗光及測眼軸長度。采用細胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的RPE細胞,用免疫細胞化學法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。

1.2.2 免疫細胞化學方法檢測

1.2.2.1 實驗方法

將長有RPE細胞的蓋玻片放入濕盒內(nèi),每張玻片加50μl Triton室溫下通透15分鐘,PBS沖洗3×5min。鏈親和霉素-過氧化物酶溶液浸泡6min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗3×5min。高壓鍋加熱抗原修復液處理2min,室溫冷卻20min,PBS沖洗3×5min。滴加稀釋的50μl一抗(37℃孵育60min,PBS沖洗3×5min。滴加生物素標記的50μl二抗,室溫40min,PBS沖洗3×5 min。DAB顯色,取Iml蒸餾水加試劑盒中A,B,C試劑各一滴,混勻后加至玻片上,室溫顯色,鏡下控制反應時間,一般在5-10min之間(胞漿呈棕黃色為陽性),蒸餾水充分洗滌終止顯色時間。自來水充分沖洗,蘇木素復染10min,梯度脫水,中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性空白對照:以PBS代替一抗,作陰性對照。

1.2.2.2 結(jié)果判定

由經(jīng)驗豐富的病理科技師采用雙盲法獨立觀察,每張細胞爬片觀察高倍鏡(LM×400)下3個視野,陽性效應產(chǎn)物為棕黃色顆粒。陰性無表達;+著色淺,成淡黃色 高倍鏡下明確陽性;++ 著色中等,棕黃色 低倍鏡下明確陽性;+++ 大量,棕色 著色深;++++ 密集片狀,深棕色 著色強烈。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測TGF-βmRNA

1.2.3.1 目的基因引物的合成

引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH上游引物:5’-TGAACGGGAAGCTCAC TGG-3’下游引物:3’-GCTTCACCACCTTCTTGAT GTC-3’TGFβ124bp5’-CCCAGAGTGGTTGTCCT TTGA-3’5’-GCGGAGCGT GTTATCTTTGCT-3’

1.2.3.2 提取RNA的完整性檢測及提取RNA的定量

標本及組織總RNA留取后,取RNA溶液4ul,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,明顯可見28S、18S條帶,且28S為18S條帶的兩倍,5S條帶較弱,且彌散,表明RNA降解較少,完整性良好。用756型紫外分光光度計分別測定OD260與OD280,OD260/OD280比值在1.8-2.0之間,表明提取的RNA蛋白污染很少,因此可于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應。用756型紫外分光光度計測量OD260/OD280比值,可檢測RNA的純度和含量,選用OD260/OD280比值為1.8-2.0的RNA用作反轉(zhuǎn)錄。RNA含量采用紫外分光光度計檢測法。

1.2.3.3 Syber Green熒光定量PCR檢測:(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I),BBI)

PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃ 4min,然后三步反應:94℃ 30S,58℃ 30s,72℃ 30s,進行40個循環(huán),于每個循環(huán)的第三步72℃ 30s收集熒光信號。選擇數(shù)據(jù)分析方式,用實時熒光定量PCR結(jié)果分析。本試驗采用相對定量法中的CT值比較法檢驗基因的表達變化。擴增完畢后,進入結(jié)果分析界面,以GAPDH為內(nèi)參照基因,與對照組相比,得到目的基因表達的相對定量值(RQ值),我們將RQ值用于統(tǒng)計分析。

1.2.4 western-blot印跡法從蛋白表達水平定量檢測TGF-β

1.2.4.1 蛋白質(zhì)抽提及定量

收集各組細胞,用冷PBS洗滌3次后,將細胞重懸于細胞裂解液中,冰浴6 min,使細胞充分裂解。離心,收集上清,分裝凍存。配置BCA工作液(WR);分別吸25ul標準品、待測樣品.至微孔板對應孔中,每孔加入200ul的WR,震板6秒以徹底混合均勻:蓋好微孔板,37℃孵育6分鐘:冷卻至室溫;測量各孔590nm的吸光度值;測得的每個標準孔和待測樣品孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值;以校正過的BSA標準蛋白測量值對其濃度(ug/ml)做圖繪制標準曲線。使用標準曲線定量待測樣品蛋白濃度。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)PVDF膜

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后對凝膠進行半干轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜緩沖液為48 mmol/L Tris,39 mmol/L甘氨酸,1.3 mmol/L SDS,20 % 甲醇,pH 9.2)。半干式轉(zhuǎn)膜槽陰極在上,陽極在下。緩沖液為連續(xù)緩沖液,蛋白質(zhì)移動方向由上而下。轉(zhuǎn)移電流50～250 mA,轉(zhuǎn)移時間20～60 min。封閉:轉(zhuǎn)膜完畢,取出 PVDF 膜,置于含5 % 脫脂奶粉的TTBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl,0.05 % Tween-20)封閉液中,于室溫封閉2 h。一抗結(jié)合:將封閉后的PVDF膜置入TTBS適當稀釋的一抗溶液中,4 ℃緩慢搖動過夜。洗膜:取出PVDF膜放入盛有適量TTBS的平皿中,室溫洗膜,每次10 min,共3次。二抗結(jié)合:將PVDF膜置入適量以TTBS 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中,于室溫反應2 h?；瘜W發(fā)光法檢測:用TTBS室溫洗膜3次,每次10 min,然后用TBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl)洗膜1次,約5 min。抗體結(jié)合區(qū)帶用化學發(fā)光法檢測。信號強度用Bio 1D圖像分析軟件進行相對定量分析。

1.2.5 盲法處理

以上檢影驗光及所有測量均山另一位專業(yè)人員操作,操作人員不知被檢眼是實驗眼還是對照眼。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 細胞鑒定結(jié)果

細胞免疫化學法鑒定顯示:RPE細胞keratin染色陽性,胞漿內(nèi)可見大量棕色陽性反應產(chǎn)物,S-100染色弱陽性,胞漿內(nèi)多呈棕黃色,Vimentin染色陰性,Desmin染色陰性,證實所培養(yǎng)的細胞為RPE細胞(Fig 1A-D)。

2.2 免疫細胞化學方法結(jié)果

TGF-β2的表達定位于細胞漿和細胞核。各誘導時間段前部及后極部RPE細胞均有TGF-β2的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2的陽性表達率高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細胞于15天陽性表達率較高,30天陽性表達率最高;后極部RPE細胞于6天表達率開始較高,至15天陽性表達率最高,以后保持較高的陽性表達率,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細胞于30天較前部RPE細胞陽性表達率仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無顯著意義(P>0.05)(Fig 4 A～F,Table 1)。

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果

各誘導時間段前部及后極部RPE細胞均有TGF-β2mRNA的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2mRNA的表達量高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細胞于15天表達量較高,至30天表達量最高;后極部RPE細胞于6天表達量較高,至15天表達量最高,以后保持較高的表達量,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細胞于30天較前部RPE細胞表達量仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無顯著意義(P>0.05)。(Fig 3,Table2)。

2.4 western-blot印跡法結(jié)果

各誘導時間段前部及后極部RPE細胞均有TGF-β2蛋白的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2蛋白的表達量高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細胞于15天表達量較高,至30天表達量最高;后極部RPE細胞于6天表達量較高,至15天表達量最高,以后保持較高的表達量,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細胞于30天較前部RPE細胞表達量仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無顯著意義(P>0.05)。(Fig 2,Table 3)

圖1 豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞的細胞免疫化學法鑒定結(jié)果(×400)A:keratin(+);B:S-100(±);C:Vimentin(-);D:Desmin(-)

圖2 豚鼠前部及后極部RPE細胞中TGF-β蛋白表達1:對照組前部;2:實驗組前部(6days);3:實驗組前部(15days);4:實驗組前部(30days);5:對照組后極部;6:實驗組后極部(6days);7:實驗組后極部(15days);8:實驗組后極部(30days)

Note:*P<0.05圖3 豚鼠前部及后極部RPE細胞中TGF-βmRNA表達的對比1:實驗組前部;2:實驗組后極部;3:對照組前部;4:對照組后極部

圖4 豚鼠RPE細胞中TGF-β的細胞免疫化學法陽性表達(×400)A:實驗組前部(30days);B:實驗組后極部(30days);C:實驗組前部(15days);D:實驗組后極部(15days);E:實驗組前部(6days);F:實驗組后極部(6days);G:對照組前部;H:對照組后極部

TGF-β2時間組別部位眼數(shù)-++++++++++陽性率誘導前實驗組前部105122050%后極部105131050%對照組前部106211040%后極部105320050%6天后實驗組前部104112260%c后極部101123390%a,b對照組前部106211040%c后極部105320050%c15天后實驗組前部102031480%a,b后極部1000136100%a,b對照組前部105211150%c后極部104321060%c30天后實驗組前部101022590%a,b后極部1000136100%a,b對照組前部107111030%c后極部106121040%c

注:實驗組與對照組比較aP<0.05;實驗組與誘導前比較;bP<0.05,對照組與誘導前比較;cP>0.05

表2 RPE細胞中不同時期TGF-βmRNA表達的對比

注:實驗組與對照組比較aP<0.05,實驗組與誘導前比較bP<0.05,對照組與誘導前比較cP>0.05

表3 RPE細胞中不同時期TGF-β蛋白表達的對比

續(xù)表3

時間點組別部位TGF-ββ-actionTGF-β與β-action的OD比值后極部95.367±2.153522.56±5.3780.1824±0.004c15天后實驗組前部115.48±3.756522.13±5.5690.2211±0.008a,b后極部463.01±6.825520.34±4.8570.8898±0.015a,b對照組前部93.145±1.879518.37±5.4410.179±0.003c后極部98.215±1.285524.93±3.9910.1871±0.003c30天后實驗組前部273.42±6.287523.16±3.5130.5210±0.014a,b后極部317.59±4.910524.78±3.0060.607±0.012a,b對照組前部99.147±1.740517.46±2.2340.1916±0.004c后極部96.582±2.315516.28±6.0390.1870±0.005c

注:實驗組與對照組比較aP<0.05,實驗組與誘導前比較bP<0.05,對照組與誘導前比較cP>0.05

3 討論

TGF-β是一類對細胞生長、分化具有雙向調(diào)節(jié)作用的細胞因子,它產(chǎn)生、利用和降解的部位主要在眼球的后極部,高表達于光感受器外節(jié)和RPE細胞,在脈絡膜也有輕度表達,具有促進和抑制鞏膜成纖維細胞的增生,從而進一步影響細胞外基質(zhì)的構(gòu)成,其生物活性以TGF-β2為主[2]。在生理狀態(tài)下,RPE細胞與TGF-β的關(guān)系極為密切:目前研究已知不僅眼后段TGF-β的表達和分泌的重要來源地主要位于RPE細胞[3],而且反過來,通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生的TGF-β還可以抑制RPE細胞增生[4]。另外,依據(jù)細胞類型的不同及與其他因子的共同作用的條件下,TGF-β又可發(fā)揮抑制或促進效應,從而達到雙向調(diào)節(jié)眼內(nèi)細胞間的活動的目的。以往的研究證實,當把外源性TGF-β加入人胚RPE細胞的培養(yǎng)基后,RPE細胞DNA的合成表現(xiàn)為抑制反應[5]。在研究小雞形覺剝奪性近視(FDM)模型中,Seko[6]等人發(fā)現(xiàn)后極部鞏膜組織及視網(wǎng)膜―視網(wǎng)膜色素上皮―脈絡膜復合體中TGF-β2均有明顯增加。TGF-β在實驗性近視中或人眼近視中的可能機制為:在病理性近視眼的發(fā)生發(fā)展過程中,TGF-β可能作為一種“啟動”信號因子,其表達水平顯著升高[6,7],并經(jīng)過與受體相結(jié)合,通過特定的信號傳遞系統(tǒng),作用于視網(wǎng)膜、脈絡膜或鞏膜的細胞,對眼軸的生長和近視的形成起著重要的作用。

近年來的研究還表明,不同質(zhì)量濃度的TGF-β不僅可抑制人胚RPE細胞的生長,改變RPE細胞的超微結(jié)構(gòu)[9],還可誘導人胚RPE細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化,并與其劑量成正相關(guān)[10]。TGF-β可使人RPE細胞中MM P-2 mRNA的表達上調(diào),直接改變MM P-T M P的平衡[8],從而改變細胞外基質(zhì)的正常代謝,且有學者研究發(fā)現(xiàn)TGF-β的基因表達與高度近視無關(guān)聯(lián)性[11]?？梢奣GF-β與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它既可改變細胞的形態(tài),又可影響與近視相關(guān)的細胞外基質(zhì)的代謝和細胞內(nèi)因子的分泌。

本研究成功建立了豚鼠透鏡誘導近視眼動物模型,在實驗中,我們希望通過分不同誘導時間、不同部位(前部和后極部)觀察實驗眼和對照眼RPE細胞TGF-β2及TGF-β2mRNA的動態(tài)表達變化,揭示TGF-β與近視眼后極部眼軸延長的關(guān)系。結(jié)果顯示透鏡誘導豚鼠近視眼RPE細胞中TGF-β2及TGF-β2mRNA的陽性表達率明顯高于對照眼;各誘導時間段前部及后極部RPE細胞均有TGF-β2的表達,后極部RPE細胞于6天表達較高,前部無明顯變化,前部及后極部的表達有顯著性差異;前部RPE細胞于15天表達較高,至30天時,后極部表達較前部表達,仍有顯著性差異。推測在透鏡誘導豚鼠近視眼形成過程中,RPE細胞中TGF-β2活性升高從后極部開始,通過與下一級信使結(jié)合作用于后極部鞏膜成纖維細胞;隨著誘導時間推移,整體RPE細胞中TGF-β2的活性也升高,但仍以后極部為主,并穩(wěn)定于一定濃度。因此.本研究首次揭示的RPE細胞的TGF-β表達的前后差異.很可能與鞏膜的正常生長發(fā)育有關(guān),并進一步與實驗中近視的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)的調(diào)節(jié)處于一種微妙的平衡狀態(tài),透鏡誘導可以影響TGF-β的分泌平衡,造成豚鼠近視眼的形成和發(fā)展。

本研究由于時間有限,只對RPE細胞中TGF-β及TGF-βmRNA的表達進行了半定量及定量研究。RPE細胞中TGF-β有陽性表達,參與豚鼠實驗性近視眼的形成,但是哪些信號使TGF-β表達發(fā)生改變,而TGF-β又是通過怎樣的途徑到達鞏膜,引起鞏膜改變的信號又是什么,抑制TGF-β的表達能否減輕近視眼眼軸延長,還有待于進一步研究,另外由于時間緊迫,未對“RPE-脈絡膜級聯(lián)系統(tǒng)”[12]中的脈絡膜黑素細胞進行研究,下一步實驗還有待完善。

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Altered TGF-β2 expression in retinal pigment epithelial(RPE)cells from an experimentally-induced myopia guinea pig model

CHENBo-Yu,WANGChao-ying,CHENWei-yi

(1.FromtheDepartmentofOphtalmology,theBethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang,Hebei,050082;3.DepartmentofBiomechianicsResearch,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan,Shanxi,030001)

Objective To observe the expression of transforming growth factor-β2(TGF-β2)in cultured guinea pig anterior and posterior retinal pigment epithelial(RPE)cells in lens-induced myopia(LIM).Methods Three groups(n=10)of two-week-old guinea pigs were used to develop concave lens-induced myopia(LIM)in one eye via the out-of-focus method for 6,15 or 30 d,respectively,while the other eye in each guinea pig served as the self-control(SC).After myopia induction,lenses were removed,and RPE cells were cultured and passaged twice.TGF-β2 expression levels of retinal pigment epithelial(RPE)cells in LIM and SC groups were compared by immunocytochemistry,quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and Western blot analyses.All datas were statistically analyzed by SPSS 13.0 system.Results The TGF-β2 expression of the anterior portion of the RPE cells in the LIM group was significantly higher at 15 d and the highest at 30 d after myopia induction compared with the SC group(P<0.05).The TGF-β2 staining of the posterior RPE cells in the LIM group began to rise significantly at 6 d,peaked at 15 d and remained significantly higher than that of the anterior part,as well as the SC group,even at 30 d after myopia induction(P< 0.05).Conclusion During myopia development in lens-induced guinea pigs,the increase in TGF-β2 activity of RPE cells initiated at the posterior pole.Along with the induction time,the TGF-β2 activity in all RPE cells became elevated.

Guinea pig; Retinal Pigment epithelial(RPE)cells; Transforming growth factor-β2(TGF-β2); Immunocytochemistry; Real-Time PCR Analysis; Western blotting

《力學信號對實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞、鞏膜成纖維細胞的影響》河北省自然科學基金資助項目(No.H2012505009)

1.050802,河北石家莊,白求恩國際和平醫(yī)院眼科;2.030001,山西太原,太原理工大學大學生物力學研究所

陳博宇,E-mail:chenby2190@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.04.002

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