復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解羊骨粉的研究

王鈺慧，甄守艷，霍乃蕊，張琪，郭娟

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

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復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解羊骨粉的研究

王鈺慧1，甄守艷1，霍乃蕊2*，張琪1，郭娟1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：為了進(jìn)一步提高水解程度，以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解羊骨粉，比較同步水解和順序水解效果，確定較優(yōu)水解方式和條件。結(jié)果表明兩種酶的順序水解效果不及同步水解。雙酶同步水解整體上優(yōu)于單酶水解，且底物濃度9%、pH7.5時(shí)各指標(biāo)均高于底物濃度12%、pH6時(shí)的水解效果。本研究確定的這兩種酶水解羊骨粉的方式為同步水解，條件為：骨粉添加量9%、復(fù)合蛋白酶添加量5%(E/S)、風(fēng)味蛋白酶添加量為4.25%(E/S)、調(diào)節(jié)起始pH值為7.5，50 ℃水解315 min，此時(shí)的水解度為29.21%、氨基態(tài)氮含量為27.29%、多肽生成量為87.13 mg·g-1、短肽得率為57.24%，其中多肽生成量和短肽得率極顯著地高于單酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

關(guān)鍵詞：復(fù)合蛋白酶；風(fēng)味蛋白酶；同步水解；順序水解；骨膠原肽

我國(guó)羊骨資源豐富，酶解是羊骨深加工的一種有效渠道，可實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能的雙重改善[1],提高其附加值和利用效率。羊骨蛋白中90%以上為膠原蛋白,一般水解度越大,膠原多肽或膠原短肽的得率也越大，膠原肽的生理活性便越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是水解羊骨粉制備膠原多肽水解度最大的3種酶。為了進(jìn)一步提高水解度，本研究以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解羊骨粉，比較同步水解和順序水解效果，確定較優(yōu)水解方式和條件，為羊骨深加工提供參數(shù)支持，并有助于養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)鏈的延伸。

1材料

1.1　原料與試劑

脫脂羊骨粉由實(shí)驗(yàn)室自制。風(fēng)味蛋白酶(酶活≥20 000 U·mg-1，廠家：Solarbio)，復(fù)合蛋白酶(酶活≥120 000 U·mg-1，廠家：Solarbio)。OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，絲氨酸、酪氨酸等均為分析純。

1.2　儀器設(shè)備

722G可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge23R，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；802型索式抽提器(天津市玻璃儀器廠)等。

2方法

2.1　風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶最優(yōu)水解條件

經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定的風(fēng)味蛋白酶最優(yōu)水解條件為：料液比12%(W/V)、加酶量為3.48%(E/S)，調(diào)節(jié)起始pH值為6，55 ℃水解315 min，水解度約為20.38%。同樣方法確定的復(fù)合蛋白酶最優(yōu)水解工藝為pH 7.5，料液比為9%，加酶量為5%(E/S)，55 ℃水解300 min、水解度約為28.54%。

2.2　指標(biāo)測(cè)定

酶解結(jié)束后，5 000 r·min-1離心15 min, 取上清液進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定采用中性甲醛滴定法[2]；水解度測(cè)定采用鄰苯二甲醛法[1]；多肽生成總量以不被TCA所沉淀的多肽計(jì)算,其中總氮測(cè)定采用福林-酚法[3]；短肽不被15%TCA所沉淀，15%三氯乙酸中的可溶性氮的測(cè)定采用福林-酚法，原料中總氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定。

2.3　同步水解

這兩種酶在優(yōu)化的單酶水解工藝條件中水解溫度相同，但底物濃度和pH值不同，為此設(shè)計(jì)表1、表2。分別探討在9%、12%料水比時(shí)不同pH條件下，50 ℃水解315 min的雙酶水解效果，并將其與單酶最優(yōu)水解條件下的各指標(biāo)進(jìn)行比較。

2.4　順序水解

在底物濃度9%時(shí)，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按順序在最優(yōu)條件下水解，確定二者的較適時(shí)間比。底物濃度為12%時(shí)，先風(fēng)味蛋白酶后復(fù)合蛋白酶水解羊骨粉，確定較適時(shí)間比。

2.5　統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Statistix 8.1軟件進(jìn)行方差分析。

3結(jié)果與分析

3.1　同步水解結(jié)果

由表1可以看出，對(duì)于水解度而言，只有AB4組顯著高于B組，其他組別之間差異不顯著；對(duì)于水解液中的氨基態(tài)氮含量，所有AB組合以及A組均顯著高于B組。但B組的多肽生成量顯著高于其他各組，AB4組顯著高于其他雙酶組合及A組。AB4組的短肽生成量顯著高于其他雙酶組合及A、B單酶水解，因此當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，兩種酶同時(shí)水解，pH7.5是較優(yōu)條件。

表1　羊骨骨粉(9%)復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶同步水解及各水解指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

注：A為復(fù)合蛋白酶;B為風(fēng)味蛋白酶;AB表示雙酶同步水解。數(shù)值右上角不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異顯著(p<0.05)，表2同。

Note：A：Protamex; B：Flavourzyme;AB stands for simultaneous hydrolysis by A and B. Different letters to the up-right corner of the value means significant difference. Same to table 2.

由表2可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?2%時(shí)，反應(yīng)310 min，同步水解的水解度均高于底物濃度為9%的水解度，說(shuō)明底物濃度對(duì)其影響較大。底物濃度為12%時(shí)，雙酶酶解的水解度均顯著高于風(fēng)味蛋白酶。氨基態(tài)氮含量各組之間差異不顯著，風(fēng)味蛋白酶B單酶水解多肽生成量顯著高于其他組，AB1組顯著高于其他雙酶組及A組，且AB1組的短肽得率顯著高于其它組合及單酶水解。因此當(dāng)?shù)孜餄舛葹?2%時(shí)，雙酶水解的較適pH值為6。

表2　羊骨骨粉(12%)復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶同步水解及各水解指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

3.2　順序水解

由表3可以看出，當(dāng)時(shí)間比為1∶1時(shí)，水解度最大，顯著高于3∶1和1∶3，但與其他組差異不顯著，且與同步水解的最大水解度大致相同；氨基態(tài)氮數(shù)值在時(shí)間比為1∶1時(shí)，數(shù)值最大，與其他組差異不顯著，但高于同步水解。所有比例的多肽生成量顯著低于同步水解。最大短肽生成量也與同步水解數(shù)值相近。總之，先復(fù)合后風(fēng)味蛋白酶的順序水解效果不及同步效果好。

由表4可知，無(wú)論何種時(shí)間比例，水解度均高于同步水解，但氨基態(tài)氮含量、多肽生成量整體上低于同步水解和先復(fù)合后風(fēng)味蛋白酶的順序水解。短肽生成量的最大值也低于同步水解和先復(fù)合后風(fēng)味蛋白酶的順序水解。

表3　底物濃度9%時(shí)復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶以不同時(shí)間比順序水解羊骨骨粉效果比較

注：酶解總時(shí)間為620 min。數(shù)值右上角不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異顯著(p<0.05)。表4同。

Note: The total reaction time was 620 min. Different letters to the up-right corner of the value means significant difference. Same to table 4.

表4　骨粉濃度為12%時(shí)風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶不同時(shí)間比雙酶順序水解結(jié)果

4討論

復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是水解羊骨粉效果較好的兩種酶，雙酶復(fù)合水解將會(huì)加大水解程度，產(chǎn)生更多的多肽或短肽，這樣其生物利用度和活性功能將會(huì)更強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，同步水解效果優(yōu)于順序水解，且順序水解操作麻煩，耗時(shí)很長(zhǎng)。由于兩種酶最優(yōu)工藝條件下的底物濃度分別為9%和12%，pH值分別為7.5和6，為此研究確定了底物濃度為9%時(shí)的較適pH值為7.5，此時(shí)的水解度、氨基態(tài)氮含量、多肽生成量及短肽得率分別為29.21%、27.29%、87.13 mg·g-1和57.24%；底物濃度12%時(shí)的較適pH值為6,此時(shí)各指標(biāo)數(shù)值分別為 29.34%、26.42%、85.34 mg·g-1和55.96%，可見(jiàn)前者優(yōu)于后者。雖對(duì)氨基態(tài)氮含量沒(méi)有顯著影響，但水解度顯著高于風(fēng)味蛋白酶單酶作用(p<0.05)，多肽生成量和短肽得率亦極顯著高于單酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

陳晶等用復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶對(duì)魚(yú)骨蛋白進(jìn)行分步水解，可使水解度提高[4]，詹萍等優(yōu)化了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的分步水解羊骨的工藝[5]。本研究結(jié)果卻表明分步水解即順序水解對(duì)水解程度的增強(qiáng)作用沒(méi)有同步水解強(qiáng)。這些研究者們僅僅考察了水解度一項(xiàng)指標(biāo)，而本研究還考察了氨基態(tài)氮、多肽、短肽等多項(xiàng)指標(biāo)，因此結(jié)果將更可靠。

以本研究確定的同步水解工藝水解羊骨粉，其多肽生成量和短肽得率比單酶水解的最大值分別提高了28.6%和31.9.%。短肽越多，羊骨膠原肽的生理活性將越強(qiáng)，研究證實(shí)，羊骨膠原肽具有防治骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫、降血壓等功能[6，7]，其它功能還有待進(jìn)一步研究。

5結(jié)論

復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶順序水解效果不及同步水解效果。雙酶同步水解整體上由優(yōu)單酶在最優(yōu)工藝參數(shù)下的水解，且底物濃度9%、pH 7.5時(shí)的水解效果優(yōu)于底物濃度12%、pH6時(shí)的水解效果。因此這兩種酶本研究確定的復(fù)合水解條件為：骨粉添加量9%、復(fù)合蛋白酶添加量5%(E/S)、風(fēng)味蛋白酶添加量為4.25%(E/S)、調(diào)節(jié)起始pH值為7.5，50 ℃水解315 min，此時(shí)的水解度為29.21%、氨基態(tài)氮含量為27.29%、多肽生成量為87.13 mg·g-1、短肽得率為57.24%，其中多肽生成量和短肽得率極顯著地高于單酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

參考文獻(xiàn)

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(編輯：馬榮博)

Hydrolyzing of sheep bone powder using protamex and falvorzyme

Wang Yuhui1, Zhen Shouyan1, Huo Nairui2*, Zhang Qi1, Guo Juan1

(1．CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:Protamex and flavorzyme were used sequentially or simultaneously to further improve the degree of hydrolyzing of sheep bone powder and to determine the better pattern and condition for hydrolyzing. Results suggested that simultaneous pattern was better than sequential pattern. 9% bone powder at pH 7.5 was better than 12% at pH 6. Hence the determined pattern for double-protease hydrolysis of sheep bone powder was simultaneous style and the condition was 9% substrate, 5%(E/S) protamex, 4.25%(E/S) flavorzyme, pH 6，50 ℃, 315min. Under this condition, the degreee of hydrolysis, amount of amino-acid nitrogen, reached to 29.21% and 27.29%. The amount of formed polypeptides and the obtaining rate of oligopeptides reached to 87.13 mg·g-1and 57.24% respectively which is extremely higher than 67.75 mg·g-1and 43.39% of single-enzyme pattern(P<0.01).

Key words:Protamex; Flavorzyme; Simultaneous hydrolyzing; Sequential hydrolyzing; Ossein peptide

中圖分類號(hào)：TS251.94

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)01-0057-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31201347)、山西省回國(guó)留學(xué)人員項(xiàng)目(2014-042)

通訊作者：*霍乃蕊，博士，教授。Tel：13935452616 ；E-mail:tgnrhuo@163.com

作者簡(jiǎn)介：王鈺慧(1989-)，女(漢)，山西萬(wàn)榮人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

收稿日期：2015-11-16修回日期：2015-11-27